Молекулярная биология и генетика кальциевых АТФ-аз, их роль в сердечно-сосудистых заболеваниях

Список сокращений …………………………………………………………….3 Введение …………………………………………………………………………4 Глава1. Теории о роли кальция и кальциевых АТФ-аз при сердечно- сосудистых патологиях………………………………………………………….9 1.1. Ионизированный кальций, сердце и функции гемодинамики…………..9 1.1.1. Кальций и активность клеток сердца…………………………………..10 1.1.2. Ионы кальция и функция сердца………………………………………..13 1.3. Генетические аспекты патогенеза С.Н…………………………………….17 1.4. Адренергическая стимуляция и систолическая дисфункция…………….20 1.5. Другие аспекты С.Н………………………………………………………...24 1.5.1.Дилатационная кардиомиопатия…………………………………………30 1.5.2. Генетический полиморфизм и фармокогенетика С.Н………………..36 Глава 2 Материалы и методы исследования…………………………………..40 2.1. Материалы исследования…………………………………………………..40 2.2. Методы………………………………………………………………………42 2.2.1 Выделение ДНК из крови на магнитных частицах SiO2……………….42 2.2.2. Выделение суммарной РНК набором Yellow Solve……………………47 2.2.3. Обратная транскрипция (ОТ)…………………………………………….50 2.2.4. Постановка ПЦР…………………………………………………………..52 2.2.5. Электрофорез……………………………………………………………..59 Глава 3. Результаты и их обсуждение………………………………………….64 Заключение……………………………………………………………………… Выводы………………………………………………………………………… Список литературы…………………………………………………………

Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, которыйбы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у исследуемого гена. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15-30 нуклеотидов.Компоненты реакцииДля проведения ПЦР потребовались следующиекомпоненты:-ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требовался амплифицировать;-праймеры: моноаминодоксидазы (МАО), ангеотензин(АСЕ),PGC 1Alfa, NRF2, INOSVNTR, IL-1R, IL-6F; -однократный буфер, обеспечивающий необходимые условия реакции-PH, ионную силу раствора;-стерильная вода;-dNTP(трифосфаты, в состав которых входят ионы магния, необходимые для работы полимеразы);-термостабильная ДНК-полимераза‒ фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокойтемпературе длительное время, поэтому использовала фермент, выделенный из термофилов (Taq-полимераза);-минеральное масло, чтобы избежать испарения реакционной смеси.Оборудование и приборы:-штатив;-автоматические пипетки;-стерильные носики для пипеток;-стерильные пробирки;-термостат;-прибор «ТАРЦИК»- обеспечивает периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1°С.Постановка ПЦР(генотипирование ДНК крови на гены АСЕ,МАО,PGC1Alfa, INOS VNTR,NRF2, IL-1R, IL-6F):1.Чистые, стерильные пробирки пронумеровала и на каждой поставила дату проведения постановки ПЦР. 2.Составление Мастера Микса смеси:Мастер микс смесиНа 1 пробуНа 10 проб (МАО) моноаминодокидазНа 10 проб ангеотензина(АСЕ)Однократный буфер5 мкл50 мкл50 мклdNTP (трифосфаты)2 мкл20 мкл20 мклddH2O (стерильная вода)40 мкл400 мкл400 мклПраймеры: F1-прямой 1 мкл10 мкл10 мклF2-обратный1 мкл10 мкл10 мклВсе эти компоненты с праймерами моноаминодоксидаз смешивала в одной пробирке, а с праймерами ангеотензина в другой пробирке. Далее разлилаготовый мастер микс смеси в другие чистые, стерильные и пронумерованные пробирки по 48 мкл в каждую.3. Все пробирки перенесла в термостат с температурой 80°С на 5 минут (предварительная денатурация).4.Добавила в каждую пробирку со смесью Мастера Микса по 0,5 мклфермента ( Taq-полимеразы).5.Так же в каждую пробирку добавила по 1 мклДНК-матрицы.6. Добавила минеральное масло в каждую пробирку по 70 мкл.7. Все пробирки из термостата помещаем в аппарат ПЦР «ТЕРЦИК».8.После окончания проведения ПЦР на аппарате «ТЕРЦИК»,перенесла пробирки в термостат при температуре 72°С на 7 минут (финальная стадия элонгации).Ход реакцииОбычно при проведении ПЦРвыполняется 32-36 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.1. Стадия денатурацияДвухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96°Сна 0,5–2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.Перед первым циклом (до добавлении Taq-полимеразы) проводила предварительный прогрев реакционной смеси в течение 5 минут, для полной денатурации матрицы и праймеров. Этот прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.2. Стадия отжигКогда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4-5°Сниже их температуры плавления. Время стадии 0,5- 2 минуты. Неправильный выбор отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при повышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при сниженной температуре).3. Стадия элонгацияДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Эта стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы.Используемая Taq-полимераза наиболее активна при 72°С. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальнойэлонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 минут.Рисунок 7. Аппарат ПЦР «ТЕРЦИК» и термостат.Рисунок 8.Подготовленнаяпробадляпроведения реакции ПЦР.2.2.5.Электрофорез.Материалы-1 г агарозы;-0,5 кратный буфер для приготовления агарозного геля;-100 мл дистиллированной воды;-однократный ТАЕ-буфер для электрофореза.Подготовка реагентов1.Приготовление 3% агарозы:- в колбу объемом 1л поместила 1г агарозы, добавила 100 мл дистиллированной воды и 2 мл 50-кратного ТАЕ-буфера.-агарозу нагревала в микроволновой печи до полного расплавления.2.Приготовление однократного ТАЕ-буфера:-20 мл 50-кратного ТАЕ-буфера разбавила 1 л дистиллированной воды.Получила однократный ТАЕ-буфер для электрофореза.Оборудование-прибор горизонтального электрофореза;-источник питания (источник постоянного тока);-трансиллюминатор;-фото с фильтрами для съемки в УФ;-автоматические пипетки;-носики для автоматических пипеток; -стерильные медицинские перчатки.Подготовка проб с ПЦР:1.В каждую лунку плашки внесла по 3 мкл краски;2.Добавила2 мкл маркера в первую и вторую лунки плашки;3. В остальные лунки внесла по 6 мкл образцовПЦР-ДНК;4.Из каждой лунки плашки взяла по 9 мкл и внесла в лунки геля.В первую и 13 лунки - внесла маркер,со 2 по 11 лунки внесла образцы ПЦР-ДНК, в 12 лунку внесла образец- контроль ПЦР-ДНК. Постановка электрофореза1.В специальную ванночку прибора горизонтального электрофореза добавила однократный ТАЕ-буфер на 1-1,5 сантиметра от дна;2.Ванночку и гребенку промыла под проточной водой, ополоснула дистиллированной водой;3.Гребенку положила на ванночку ровно;4.В агарозный гель добавила реагент бромистый этидий. Бромистый этидий встраивается в состав ДНК и светится;5.В специальную ванночку с гребенкой внесла расславленный агарозный гель комнатной температуры и дала остыть в течение получаса;6.После застывания агарозы гребенку аккуратно достала, стараясь не повредить образовавшиеся лунки;7. Внесла 13 подготовленных проб в лунки геля;8.Гель поместила в ванночку для элктрофореза;9. Закрыла крышку электрофорезаи подключила к источнику тока на 30 минут -110 вольт, ток-74 милиампера.Статистическая обработка данных была проведена с использованием программы Microsoft Excel и t-критерия Стьюдента.ОтдельныеэтапыанализарезультатовПЦРметодомэлектрофорезавгеляхагарозы.Рисунок 9.Аппарат горизонтального электрофореза. Рисунок 9. Подготовка агарозногогеля.Рисунок 10.Подготовкапробдлянанесениянагель.Рисунок 11. ГельсрезультатамиЭФанализапробспродуктамиПЦРреакции.Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение.Работа выполнена на образцах ДНК, предварительно выделенных из лейкоцитов периферической крови с применением методов ПЦР, ферментативного гидролиза и электрофореза в агарозномгеле. Проведено изучение 100 человек в двух возрастных группах. Первая возрастная группа состояла из 50 лиц в возрасте старше 35 лет и вторая из 50 лиц старше 60 лет (Городская Клиническая Больница №4), проживающих на территориигорода Москвы и Московской области. У исследуемых пациентов были выявлены следующие заболевания: -ишемическая болезнь сердца (ИБС); -гипертоническая болезнь (ГБ); -острый инфаркт миокарда (ИМ);-кардиомиопатии;-острая сердечная недостаточность;-повторный инфаркт миокарда. Методом ПЦР-анализа была исследована частота повторов генотипов в промоторной области генов РGС-1α, MAO, ACE, PPARD,IL-1R, IL-6F, NRF2, INOS,VNTR в образцах ДНКпациентов старше 35 лет и 60 лет, проживающих в Москве и Московской области.Смесь для амплификации на 10 проб объемом 490 мкл включала 50 мкл однократного буфера, 20 мкл dNTP (трифосфаты); 400 мкл ddH2O (бидистерильная вода);по 1 мклпраймеров(F-прямого и R- обратного) на 1 пробу; 1 мкл ДНК на 1 пробу; под слой, состоящий из 70 мкл минерального масла, было добавлено 0,5 мкл фермента (Tag –полимеразы) комнатной температуры на 1 пробу. Для амплификации использовала программируемый ДНК-амплификатор «ТЕРЦИК».Праймеры подбирались с использованием компьютерного анализа на соответствующих сайтах:-Праймер 03;-NT;-BLASTДля амплификации фрагментов генов PGC-1α,кальциеваяАТФаза(SERCA 2), ACE, INOSVNTR, IL-1R, IL-6F, NRF2 были использованы праймеры фирмы «СИЛЕКС». После предварительной денатурации ДНК (5 минут при 80°С в термостате проводили 40 циклов амплификации в режиме: денатурация образовавшихся двунитевых структур при 94°С — 1 мин., гибридизация ДНК с праймерами (отжиг праймеров) при 64°С — 1 мин., синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК (элонгация) при 72°С — 1 мин., и заключительный этап синтеза при 72°С — 5 мин в термостате.Анализ длин рестрикционных продуктов гена PGC-1 Alfa проводился электрофоретическим разделением в 3 % агарозном геле, приготовленном из 1 г агарозы, 100 мл дистиллированной воды и 2 мл однократного ТАЕ буфера в аппарате для горизонтального электрофореза.Продукты реакции окрашивала этидиум бромидом и визуализировала в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе. Учет результатовУчет результатов проводила визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель достала из ванночки и поместила на стекло трансиллюминатора. Продукты реакции амплификации выглядели в виде светящихся полос, наблюдаемых визуально в УФ-свете трансилляминатора. Результаты фиксировала посредством фотографирования геля при использовании УФ-фильтров.При обработке данных ПЦР-анализа нами были получены следующие электрофореграммы:Рисунок 12. Электрофореграмма в 3% агарозном гелегена PGC1α. Слева направо 1 и 11 ‒ маркеры молекулярного веса («Силекс», Москва), 3-12 ‒ гомозиготы.Рисунок 13. Электорофореграмма в 3% агарозном геле гена ACE. Справа налево 1 ‒ маркер молекулярного веса («Силекс», Москва), 2‒ контроль,3-4 ‒ гомозиготы, 5 ‒ гетерозигота, 6-9 ‒ гомозиготы, 10 ‒ гетерозигота, 11-12 ‒ гомозигота.Рисунок 14. Электорофореграмма в 3% агарозном геле гена INOSVNTR. Справа налево 1 ‒ маркер молекулярного веса («Силекс», Москва), 2 ‒ контроль, 3-4 ‒ гомозиготы, 5 ‒ гетерозигота, 6-9 ‒ гомозиготы, 10 ‒ гетерозигота, 11-12 ‒ гомозигота.Рисунок 15. Электрофореграмма в 3% агарозном геле разных генов. Справа налево 1 и 13‒маркер молекулярного веса («Силекс», Москва), 2‒ контроль на участок рибосомного митохондриального гена,3 и 10‒ ген ACE, 4‒ген моноаминоксидаза (MAO), 5‒ генPGC1α, 6‒ген INOSVNTR, 7‒генIL1-R, 8-9 ‒ ген IL-6F, 11-12‒ген NRF2. При анализе полученных в эксперименте электрофореграмм нами было рассчитано процентное соотношение изученных генов у пациентов разных возрастных групп с сердечной недостаточностью (табл. 4).Таблица 4. Процентное соотношение генов PGC1α, ACE, CERKA2, IL-1R, IL-6,NRF2 и INOSVNTR у пациентов разных возрастных группс сердечно-сосудистой патологией.Изученные геныПациенты от 35-90 летПроцентное соотношениеЛица старше 35 летЛица старше 60 летМ(n=30)Ж (n=20)М(n=15)Ж (n=35)PGC1α863840%ACE7631030%CERCA2312720%IL-1R12232%IL-6F21311%NRF253134%INOS VNTR41133%Согласно полученным экспериментальным данным у пациентов разных возрастных групп с сердечно-сосудистыми заболеваниями наибольшее число копий ДНК было выявлено для гена PGS1α (40%), который отвечает за регуляцию кровяного давления, влияет на возникновение артериальной гипертонии и участвует в биосинтезе фосфатидилглицерола и кардиолипина. Второе место среди изученных генов занимает ген ACE (30%), который вызывает риск возникновения сердечно-сосудистых патологий (инфаркт миокарда, гипертрофия левого желудочка, спазм коронарных сосудов). Третье место занимает ген CERCA2 (20%),оказывающий влияние на расслабление мышц сердца, вследствие чего происходит не полное выкачивание кальция из мышечных волокон сердца, что приводит к гипертонической болезни. Четвертое место занимает ген NRF2 (4%), который активирует NRF2-регуляторный путь и снижает цитотоксическое действие свободнорадикальных соединений на клетки сердца, а также стимулирует продукцию ряда антиоксидантных ферментов. Пятое место занимает ген INOSVNTR (3%), а шестое и седьмое место занимают гены провоспалительных цитокинов IL-1R (2%) и IL-6F (1%).Рисунок 16. Процентное соотношение изученных генов в крови пациентов от 35 до 90 лет, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.Таким образом, в крови пациентов разных возрастных групп, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями,было выявлено наибольшее число копий ДНК PGS1α. PGC-1 коактиваторы‒ это белки, которые связываются на транскрипционных факторах и вызывают изменения структуры хроматина и транскрипционногокомплекса, приводя к стимуляции экспрессии генов. Большинство факторов транскрипции, вероятно, связываются с одним или несколькими коактиваторами для инициации транскрипции. В последнее время коактиваторы стали важной мишенью физиологических стимулирующихфакторов и гормонов. PGC-1α является наиболее изученным примером такого рода регулирющих коактиваторов. PGC-1α может связываться и коактивировать большинство членов семейства ядерных рецепторов, а также воздействовать на многие другие факторы транскрипции. Вполне вероятно, что PGC-1α приобретает большую часть своей специфичности, коактивируя различные транскрипционные факторы в различных контекстах. PGC-1α активирует транскрипцию путем связывания набора из нескольких белков, имеющих гистон ацетилтрансферазную активность. Деятельность PGC-1α можно модулировать с помощью многочисленных пост трансляционных регуляторных сигналов, включая фосфорилирование p38 МАРК и AMPK, ацетилированием гена долголетия SIRT1 [17,18], и метилирования [19]. PGC-1α имеет два структурных гомолога, PGC-1α и более отдаленные PGC-1α родственные коактиваторы (PRC), оба из которых были первоначально идентифицированы по гомологии последовательностей с PGC-1α, и которые были менее изучены. PGC-1α и окислительный метаболизм. PGC-1α коактиваторы имеют разнообразные биологические активности в различных тканях, включая сердечную мышцу, и большинство из этих активностей связаны с окислительным метаболизмом. Высокие уровниPGC-1α экспрессируются в тканях с повышенным окислительным метаболизмом, таких как сердце, мозг, почки и мышц. При эктопической экспрессии, PGC-1α индуцирует биогенез митохондрий и увеличение клеточного дыхания в культуре клеток. PGC-1α стимулирует повышение энергетики скелетной и сердечной мышц, и вследствие этого стресс зачастую сопровождается развитием быстрой сердечной недостаточности [23-26]. При трансгенной экспрессии в скелетных мышцах, PGC-1αвызывает заметнуюстимуляцию митохондриального биогенеза [28-30]. Механизм активации PGC-1α биогенеза митохондрий изучен достаточно подробно. PGC-1α коактиваторы активируют закодированные в ядре гены, вовлеченные в биогенез митохондрийчерезкоактивацию не менее трех транскрипционных факторов: NRF-1,NRF-2 и ERR. Эти факторы взаимодействуют и активируют регуляторные локусы у многих митохондриальных генов, закодированных в ядре. Гены окисления жирных кислот, которыйявляется в значительной степени митохондриальным процессом, регулируются черезкоактивацию ядерного PPARa рецептора.При изучении снижения оксидативных способностей сердечной мышцы при СН установлено, что снижение функции митохондрий как в сердечной, так и в скелетной мышцахобусловлено изменением экспрессиимитохондриальных генов, в особенностиPGC1α, а также связанных с этим геном факторов транскрипции NRF и TFAM. Сниженная экспрессия PGC1α описана в большом числе случаев СН, что однозначно свидетельствует о важной роли транскрипционнойактивности каскада генов, регулируемыхPGC1α. Это снижение является четким сигналом наличия СН, что вызывает комплексное снижение экспрессии митохондриальных белков, кодируемых как ядерным,так и митохондриальными геномами. Таким образом, согласованное снижение функции генов-регуляторов PGC1α в патологическом миокарде еще более подтверждает важность процесса биогенеза митохондрий в развитии СН.Мы проанализировали гендерные различия изученных генов у пациентов разных возрастных групп. Показано, что в группе пациентов от 35 до 60 лет наиболее активно экспрессировались гены PGC1αи ACE (рис. 16). Необходимо отметить, что уровень экспрессии геновPGC1α, CERKA2, IL-6F и INOS VNTR был значительно ниже у женщин, по сравнению с мужчинами (в 1,33 [p<0.05], 3,0[p<0.01], 2,0[p<0.05] и 4,0[p<0.01] раза соответственно).*Рисунок 16. Экспрессия изученных генов в крови пациентов от 35 до 60 лет, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.Примечание. *p<0.05, **p<0.01 по сравнению с мужчинами.При исследовании экспрессии изученных генов в группе пациентов от 60 до 90 лет были получены следующие результаты (рис. 17). Так же, как и у пациентов от 35 до 60 лет, наиболее активно экспрессировались гены PGC1α, ACE, а также CERKA2. Однако, в отличие от пациентов младшей групп (35-60 лет), уровень экспрессии PGC1α, ACE, CERKA2, NRF-2 и INOS VNTR был значительно выше у женщин, чем у мужчин (в 2,7 [p<0.01], 3,3 [p<0.01], 3,5 [p<0.01], 3,0 [p<0.05] и 3,0 [p<0.05] раза соответственно). Можно предположить, что у пациентов разных возрастных групп общие механизмы развития патологий сердечно-сосудистой системы не различались. Однако активность изученных генов значительно увеличивалась у женщин старшего возраста (60-90 лет), но снижалась у мужчин этой группы.Рисунок 17. Экспрессия изученных генов в крови пациентов от 60 до 90 лет, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.Примечание. *p<0.05, **p<0.01 по сравнению с мужчинами.В дальнейшем мы изучили полиморфизм двух генов, которые были наиболее активны у пациентов обеих возрастных групп: PGC1αи ACE. Сначала было изученосоотношение генотипов PGC1α у пациентов разных возрастных групп, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (Рис. 17).Показано, что у изученных нами пациентов наиболее распространен генотип D/D (43%). Число пациентов с генотипами I/I и I/D составляло 29 и 25% соответственно. Следует отметить, что указанные различия не обладали статистической достоверностью.Рисунок 19. Соотношение генотипов гена PGC1α у пациентов разных возрастных групп, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.Затем мы изучили соотношение генотипов ACE (ангиотензин-превращающего фермента) у пациентов разных возрастных групп, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями (Рис. 18). Показано, что у изученных нами пациентов наиболее распространен генотип D/D (48%). Число пациентов с генотипом I/I было на 31% меньше (p<0.05), а с генотипом I/D на 13% меньше (статистически недостоверно). Известно, что для пациентов с генотипом I/I характерно более высокое относительное содержания медленных волокон и низкое содержание быстрых волокон по сравнению с таковым при наличии генотипа D/D [43]. Данный факт подтверждает роль I/D полиморфизма гена ACE в детерминации как локальной, так и общей физической работоспособности.Рисунок 20. Соотношение генотипов гена ACEу пациентов разных возрастных групп, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями.Примечание. +p<0.05 по сравнению с генотипом D/D.Ангиотензин-превращающий фермент является цинк металлопротеиназой, который преобразует ангиотензин I в ангиотензин II и протеолитически инактивирует брадикинин. В течение некоторого времени было показано, что циркулирующие уровни ангиотензин-превращающего ферменташироко варьировали между отдельными лицами, но, как правило, коррелируют между членами одной семьи. Семейная конкордантность уровней ACE предполагает генетический компонент, который был идентифицирован как общий 287 б.п. вставленный (I) или удаленный (D) Alu повтор фрагмента внутри интрона 16 гена ангиотензин-превращающего фермента(находится в 17q23). Примерно половина из нормальных межличностных вариаций в плазме крови ACE у человека может быть определена ACE как I/D. ACE D/D генотип связаны с более высоким уровнем ACE активности в плазме, I/D генотип с промежуточной активностью и I/I генотип с низкой ACE активностью. Генотип D/D связан также с повышением активности АПФ в лимфоцитах человека и миокарде. Важно отметить, что в ACE I/D-полиморфизм сам почти наверняка не является причиной изменения активности ACE плазмы, и что она может вместо этого служить легко измеримым маркером для одного или нескольких других полиморфизмов ACE, с которой он находится в тесном функциональном неравновесном сцеплении. Молекулярные и клеточные механизмы повышенной экспрессии АПФ связанные с полиморфизмом ACE-I/D до сих пор не до конца изучены.После открытия ACE в I/D-полиморфизма и связанных с ним последствий в вариациях активности ACE, генотип ACE D/D был ассоциирован с возможной высокой вероятностью инфаркта, и ишемической и неишемической кардиомиопатией (с неоднозначными результатами относительно). Результаты этих исследований позволили разработать концепцию, что увеличение активации АСЕ РААС в результате наличия генотипа ACE D/D может негативно влиять на многие сердечно-сосудистые синдромы, и буквально сотни клинических исследований ассоциации с тех пор было проведено по изучению практически все мыслимых сердечно-сосудистых патолоий.Raynolds M.V. и Perryman M.B. [44]описали высокие частоты D/D генотипа при ишемической (39%) и идиопатической (36%) кардиомиопатии, чем в контрольной группе (24%). Непропорциональное представительство генотипа D/D при ишемической кардиомиопатии, возможно, было связано с аллельной ассоциацией с инфарктом миокарда, 95,96 но ассоциация с неишемической или идиопатической кардиомиопатией предлагает независимый эффект модифицирующий риск развития сердечной недостаточности. Этот ранний вывод не был подтвержден в последующих исследованиях. ACE D/D может служить неким генетическим фоном, на котором другие причины сердечной недостаточности имеют более серьезные последствия, как это было предложено в связи с его взаимосвязью с сердечной недостаточностью клиническими факторами риска гипертонии.Выявлено, что генотип D/D ACE может ускорить прогрессирование предшествующей сердечной недостаточности или отрицательно влиять на процесс выздоровления от сердечной недостаточности. Была показанамодифицирующую роль I/D генотипаACE у группы пациентов из Швеции в патогенезе сердечной недостаточности. Частота ACE D/D аллелей не является независимым фактором риска развития сердечной недостаточности, однако среди у пациентов с генотипом D/Dи сердечной недостаточностью, масса левого желудочка были больше, и продолжительность жизни ниже. Это важное открытие связывает генетический полиморфизм ACE и его эффект на активность ангиотензин-превращающего фермента и гипертрофию левого желудочка, а также прогнозы сердечной недостаточности. Последующие исследования описали патологическую связь между D/D генотипомACE и сердечной функцией или прогнозом сердечной недостаточности после инфаркта миокарда у китайской когорты пациентов с хронической сердечной недостаточностью. Также было выявленанизкая выживаемость носителей аллеля D ACE с ишемической и неишемической сердечной недостаточностью.Ангиотензин II является мощным стимулом для развития гипертрофии левого желудочка, кроме того взаимосвязь между генотипом D/D ACE, уровнем ACE и ангиотензина II, и тяжестью сердечной недостаточности свидетельствует о том, что ACE D/D генотип также может модифицировать степень гипертрофической кардиомиопатии. В частности, D/D генотип может служить фактором риска для индуцированной физической нагрузкой гипертрофии желудочков сердца у здоровых индивидов. Кроме того, выявлено, D/D генотип является независимым предиктором изменения веса сердца, но обычные факторы риска гипертонии играют более значимую роль в патогенезе нарушений сердечной деятельности.Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что D/D генотип может вносить вклад в развитие гипертрофической кардиомиопатии при условии наличия других стимулов гипертрофии. Эта парадигма подтверждается данными исследований, показывающих, что D/D генотипа ACE у здоровых людей не достаточно, чтобы развилась гипертрофической кардиомиопатии, но роль этого факторазаметно увеличивается в контексте таких предрасполагающих факторов, как гипертоническая болезнь или почечные заболевания.Выводы1.Нами были освоены методики выделения препаратов ДНК и РНК из образцов крови больных с использованием магнитных наночастиц, методики выявления различных видов полиморфизмов в генах, участвующих в развитии сердечно-сосудистых патологий. Мы наработали обширные панели образцов ДНК пациентов разных возрастных категорий с сердечно-сосудистыми заболеваниями.2.Показано, что сердечно-сосудистые заболевания сопровождаются повышением экспрессии двух основных генов: PGC1αи ACE. Выявлены гендерные различия эксперсии изученных генов у пациентов разных возрастных групп.3. Выявлено, что у пациентов разных возрастных групп, страдающих СН, генотип D/D PGC1αи ACEпреобладает над генотипами I/D и I/I. Результаты нашего эксперимента согласуются с данными ряда авторов о взаимосвязи между генотипом D/D PGC1αи ACEи наличием сердечно-сосудистых заболеваний.ЗаключениеВ представленной работе мы изучили дваосновных аспекта:Мы проанализировали роль ряда генов в развитии сердечной недостаточности у пациентов разных возрастных категорий и выявили гендерные особенности экспресии генов.Мы исследоваливлияниеполиморфизм генов, наиболее активно экспрессирующихся при СН: PGC1α и ACE, и выявили, что пациенты с СН характеризуются высокой частотой встречаемости генотипа D/D по сравнению с другими генотипами. Таким образом, выявление этого генотипа может являться признаком развития данной патологии у пациентов разного возраста.Значительные успехи генетики, расшифровка структуры генома человека позволили достигнуть большого прогресса в понимании природы и механизма возникновения ряда болезней сердца, напримеркардиомиопатии, а в последние годы также дилатационной кардиомиопатии. Исследования генетических механизмов развития СН и, в частности, полиморфизма генов, присущих данному заболеванию, может быть полезным уже в ближайшем будущем, указывая на вероятный прогноз, помогая определять показания для отдельных препаратов. В настоящее время мало известно о роли генетическихфакторов в развитии систолической и диастолической дисфункций. Несомненно, развитие фиброза, определяющего диастолическую дисфункцию, имеет иную генетическую базу, чем систолическая дисфункцию, определяемую изменениями геновсоединительнотканных клеток стромы миокарда. В перспективе возможно направленно регулировать экспрессию генов, определяющих патогенез сердечно-сосудистых заболеваний. Уже в обозримом будущемвозможно будет осуществить направленную пересадку генов не только с изменением прогрессирования СН, но и ее регрессией.Списоклитературы1. Bachinski L., Roberts R. Causes of Dilated Cardiomyopathy. CardiologyClinics. 1998; 16 (4): 603-10.2.Bristow M. Why does the myocardium fail? Insights from basic science. Lancet 1998; 352: 8-14.3. Hunter J., Chien K., Grace A. Molecular and cellular biology of cardiac hypertrophy and failure. In: Molecular basis of cardiovascular disease. Ed. Chien K. Saunders, 1999; 211-250.4. Mestroni L., Rocco C., Vatta M. et al. Advances in molecular genetics of Dilated Cardiomyopathy. Cardiology Clinics 1998; 16 (4): 611-211.5. Swynghedauw B. Molecular biology of heart failure. In: Advances in Cardiomyopathies. Eds. Camerini F., Gavazzi A., De Maria R. 1998; 147-59.6. Seidman C., Seidman J. Molecular genetics of inherited cardiomyopathies. In Chien K. (ed) Molecular basis of cardiovascular disease. Saunders Co 1999; 251-63.7. Schlant R., Sonnenblick A. Pathophysiology of heart failure. In: Hurst's The heart. Ed. Alexander R. et al. McGraw-Hill, 1998; 687.8. Packer M., Bristow M., Cohn J. et al. The effect of carvedilol on morbidity and mortality in patients with chronic heart failure. N Engl J Med 1996; 334: 1349-54. 9. Hasper D. et al. Systemic inflammation in patients with heart failure. Eur Heart J 1998; 19: 761-5.10. Cohn J. et al. Plasma norepenephrine as a guide to prognosis in patients with chronic heart failure. N Engl J Med 1984; 311: 819-23.11. Cowburn P., Cleland J., Komajda M. Risk stratification in chronic heart failure Eur Heart J 1998; 19: 696-703.12. Manolio T., Baughman K., Rodenheffer R. et al. Prevalence and ethiology of Dilated Cardiomyopathy. Am J Cardiol 1992; 69: 1458-66.13. Gregori D., Rocco C., di Lenarda C. et al. Estimating the frequency of familial dilated cardiomyopathy. Circulation 1996; 94: 1-6.14. D'Adamo P., Fassone L., Gedeon A. et al. The X-linked gene G4,5 is responcible for different infantile dilated cardiomyopathies. Am J Hm Genet 1997; 61: 862-7.15. Towbin J., Bowles K., Ortiz-Lopez R. et al. Genetic Basis of Dilated Cardiomyopathy. In: Advances in Cardiomyopathies. Eds Camerini F., Gavazzi A., De Maria R. Springer. 1998; 89-96.16. Bowles K., Gajarski R., Porter P. et al. Gene mapping of familial autosomal dominant DCMP to chromosome 10q21-23. J Clin Invest 1996; 98:1355-60.17. Olson T., Keating M. Mapping a cardiomyopathy locus to chromosome 3p22-p25. J Clin Invest 1996; 97: 528-32.18. Maeda M., Holder E., Lowes B. et al. DCMP associated with deficiency of the citosceletal protein metavinculin. Circulation 1997; 95: 17-20.19. Bonne G., Muchir A. Spectrum of mutations in laminin A/C geneimplicated in a new form of DCMP with conduction defects and muscular dystrophy. Circulation 1999; 100 (18): 255.20. Olson T., Doan T. Hypertrophic and dilated CMP are caused by mutations in the cardiac actin gene. Circulation 1999; 100 (18): 3256.21. Arbustini E., Diegoli M., Pilotto A. et al. Mitochondrial DNA mutations and CMP. In Advances in cardiomyopathies. Eds Camerini F et al. Springer 1997; 117-127.22. Ruppert V., Maisch B. Mitochondrial-DNA mutations in pts with DCMP. Eur J Heart Failure 1999; 1 (1): 16.23. Obayashi T., Tsuji K., Tanaka A. et al. Mitochondrial DNA mutation as a cause of heart failure. Eur J Heart Failure 1999; 1 (1): 72.24. Muntoni F., Wilson L., Marrosu M. et al. A mutatio in the dystrophin gene selectively affecting dystrophin expression in the heart. J Clin Invest 1995; 96: 693-9.25. Maisch B. Is familial cardiomyopathy always genetic? 22 Congress of European Society of Cardiology 2000; 28 Aug. Amsterdam.26. Mangin L., Charron P., Tesson F. Familial DCMP: clinical features in french families. Eur J Heart Failure 1999; 1: 353-61.27. ТерещенкоС.Н., ДжаианиН.А., МареевВ.Ю. идр. Влияние генов актина и дистрофина на развитие СН у больных инфарктом миокарда и ДКМП. Сердечная недостаточность 2000; 1(1): 18-20.28. SurberR., SiguschH., ReinhardtD. etal. Idiopathic dilated cardiomyopathy: association with the hereditary haemochromatosis gene. Eur Heart J 2000; 21 (Suppl. aug.): 934. 29. McKoy G., Protonotarius N., Crossby A., McKenna W. et al. Identification of a deletion in plakoglobin in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy with ceratoderma (Naxos disease). Lancet 2000; 355: 2119-24.30. Basson C., Seidman C. Genetic studies of myocardial disease. In: Textbook of cardiovascular Medicine. Ed. Topol E. Lippincott Williams. 1998; 2448.31. O'Toole L., Stewart M., Padfield P. et al. Effect of I/D polymorfism of ACE-gene on response to ACE-inhibitors in pts with heart failure. J Cardiovasc Pharmacol 1998; 32: 988-94.32. Sanderson J., Yu C., Young R. et al. Influence of gene polymorphisms of RAS on outcome in heart failure among Chinese. Am Heart J 1999; 137: 653-57.33. Anderson B., BlangeI., Sylven C. Angiotensin-II type l receptor gene polymorphism and survival in congestive heart failure. Eur J Heart Failure 1999; 1: 363-9.34. МоисеевВ.С., ТерещенкоС.Н., КобалаваЖ.Д. идр. Периндоприл в лечении сердечной недостаточности при различном генотипе АПФ. Клин. фарм. тер. 2000; 4: 22-5.35. Терещенко С.Н., Кобалава Ж.Д., Моисеев В.С. и др. Структурно-функциональное состояние сердца и эффективность ингибитора АПФ периндоприла у больных сердечной недостаточностью в зависимости от полиморфизма гена АПФ. Кардиология 2000; 1: 35-7.36. AlmazovV.A., ShlyakhtoE.V., ShwartzE. etal. Lack of association of the RAS genes polymorphism and left ventricular hypertrophy.Eur J Heart Failure. 2000; 2 (Suppl. 2): 11.37. Schannwell C., Ivens K., Leschke M. et al. Impact of ACE-genotype on LV hypertrophy and diastolic function in pts after kidney transplantation. Eur Heart J 2000; 21 (Suppl.): 179.38. Karrstedt E., Borjesson M., Anderson B. et al. Polymorphisms in the1,2,3adrenergic receptor genes among pts with congestive heart failure. Eur J HeartFailure 1999; 1 (1): 13.39. Wagoner L., Craft L., Abraham W. et al. The Iie 164 b2-adrenergic receptor polymorphism is associated with decreased exercise capacity in pts with heart failure. Circulation 1999; 100 (18): 1281.40. Shah A., White D., Baklanov D. et al. In vivo intracoronary delivery and expression of ARK inhibitor to the failing heart: prospects for molecular ventricular assistance. Circulation 1999; 100 (18): 2534.41. Kawada T., Nakazawa M., Sakamoto P. et al. Morphological and physiological rescue of DCMP by rAAV vector mediated gene transfer in vivo. EurHeartJ 2000; 21 (Suppl. aug.): 132.42. Ахметов И.И., Нетреба А.И., Глотов А.С., Астратенкова И.В., Попов Д.В., Глотов О.С., Дружевская А.М., Асеев М.В., Виноградова О.Л., Рогозкин В.А. Выявление генетических факторов, детерминирующих индивидуальные различия в приросте мышечной силы и массы в ответ на силовые упражнения // Медико-биологические технологии повышения работоспособности в условиях напряженных физических нагрузок. Вып. 3. Сб. статей. - М. - 2007. - С.13-2143. Raynolds M.V., Perryman M.B. The association between the angiotensin I converting enzyme gene polymorphism and cardiovascular disease //Coron. Artery Dis.‒ 1995.‒ 6(4). ‒ p.302-9.44. Perocchi F., Gohil V.M., Girgis H.S., Bao X.R., McCombs J.E., Palmer A.E., Mootha V.K. MICU1 encodes a mitochondrial EF hand protein required for Ca(2+) uptake // Nature. – 2010. ‒ №467. – p.291-6.45. DiMauro S. The many faces of mitochondrial diseases // Mitochondrion. ‒ 2004. ‒№4. ‒ p. 799-807.