Стандартная проба. К 1 мл рабочего стандартного раствора креатинина добавляют 3 мл пикриновой кислоты, 0,2 мл 10% раствора щелочи и 5,8 мл дистиллированной воды.
Расчет производят по формуле:
х=Еоп/Ест*10,
где х—содержание креатинина в сыворотке, мг/л; Еоп — экстинкция опытной пробы; Ест — экстинкция стандартной пробы; 10 — концентрация креатинина в стандартной пробе, мг/л.
Расчет может быть произведен по калибровочному графику. Измерения экстинкции производят в тех же условиях, что в опытных пробах. Для пересчета в единицы СИ (ммоль/л) полученные результаты умножают на коэффициент 0,0088.
Нормальные величины содержания креатинина в плазме крови: 15,25-76,25 мкмоль/л.
При концентрации креатина более 122 мкмоль/л он выделяется с мочой.
Нормальные показатели креатинина в зависимости от возраста: пуповинная кровь — 53-100 мкмоль/л; новорожденные 1 - 4 дня — 27-88 мкмоль/л; дети до 1 года — 18-35 мкмоль/л; подростки — 44-88 мкмоль/л; мужчины — 44-100 мкмоль/л; женщины — 44-88 мкмоль/л.
Концентрация креатинина в крови является довольно постоянной величиной, не зависящей от питания и других факторов. Поэтому для диагностики используется клиренс эндогенного креатинина для оценки клубочковой фильтрации почек.
Повышение содержания креатинина в крови наблюдается при:
нарушении функции почек (острая и хроническая почечная недостаточность);
мочекаменной болезни [12].
5.5. Пигменты крови (билирубин)
Билирубин образуется при распаде гемопротеидов, большая часть которых приходится на долю гемоглобина.
Определение билирубина в сыворотке крови.
При взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия образуется диазофенилсульфоновая кислота (диазосмесь), которая дает со связанным (прямым) билирубином сыворотки розово-фиолетовое окрашивание. По его интенсивности судят о концентрации связанного билирубина, дающего прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный (непрямой) билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние и также дает розово-фиолетовое окрашивание с диазосмесью одновременно с прямым билирубином. По интенсивности окраски, образующейся после добавления кофеинового реактива, определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным (прямым) билирубином находят содержание несвязанного (непрямого) билирубина.
Реактивы: 1) кофеиновый реактив (5 г ч. кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия CH3COONa растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60° С и хорошо перемешивают; после охлаждения доводят дистиллированной водой до объема 100 мл); срок хранения 2 нед;
2) 0,9% раствор хлорида натрия;
3) диазосмесь: а) диазореактив I (5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды до полного растворения, прибавляют 15 мл концентрированной хлористоводородной кислоты с относительной плотностью 1,19; после охлаждения объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой); реактив стоек; хранят в посуде из темного стекла; б) диазореактив II (0,5% раствор нитрита натрия NaNО3); реактив нестойкий; хранят в посуде из темного стекла около 2—3 нед; желтый оттенок — признак непригодности реактива; в) диазосмесь готовят перед работой, смешивая 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.
Ход определения. В 3 пробирки (для общего билирубина, прямого и для контроля) вводят реактивы в специальном порядке.
Для определения прямого билирубина в пробе измерения на ФЭКе производят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при более длительном стоянии в реакцию вступает непрямой билирубин.
При определении общего билирубина пробу оставляют стоять 20 мин. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.
Контроль на мутность сыворотки ставят для каждого опыта.
Измерение экстинкции производят на ФЭКе при зеленом светофильтре (500—560 нм) против воды в кювете с толщиной слоя 5 мм. Из показателей общего и прямого билирубина вычитают показатель контроля. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и прямого билирубина. Для определения непрямого билирубина из общего вычитают прямой билирубин.
Результаты выражают в миллиграммах на литр; для этого концентрацию билирубина, найденную по графику умножают на 2000, так как для исследования было взято 0,5 мл сыворотки. Коэффициент пересчета в единицы СИ (мкмоль/л) равен 1,7104.
Нормальные величины: 8,5-20,5 мкмоль/л [12].
Повышение содержания билирубина наблюдается:
- при гемолитических процессах;
- при острых и хронических гепатитах, закупорке желчевыводящих путей.
Для дифференциальной диагностики желтух проводят качественную реакцию на определение форм билирубина по реакции с диазореактивом (реактив Эрлиха). При развитии окраски непосредственно после добавления реактива — реакция прямая (реакция Ван ден Берга). Прямой билирубин образуется путем конъюгации его с глюкуроновой кислотой (моно- и диглюкурониды) в клетках печени. Непрямой билирубин адсорбирован на белках плазмы крови и дает цветную реакцию только после предварительной обработки (осаждение белка).
Повышение содержания прямого и непрямого билирубина наблюдается при гепатитах, закупорке желчных путей.
У здорового человека на долю непрямого билирубина приходится 75%, на долю прямого — 25% от общего билирубина.
При паренхиматозной желтухе нарушается билирубиновыделительная функция печени, а также превращение непрямого билирубина в прямой. В крови повышено содержание обеих форм, но в большей степени — непрямого билирубина.
При механической желтухе наблюдается повышение содержания прямого билирубина. Позже, при поражении паренхимы печени, увеличивается содержание непрямого. Его увеличение коррелирует с тяжестью поражения клеток печени.
При гемолитической желтухе повышено содержание непрямого билирубина, в незначительной степени повышается и содержание прямого билирубина, что свидетельствует о нарушении билирубиновыделительной функции печени.
Содержание непрямого билирубина повышается также при:
- физиологической желтухе новорожденных (снижена активность УДФ-глюкуронилтрансферазы);
- синдроме Криглера — Найяра;
- болезни Жильбера;
- токсических гипербилирубинемиях (отравление хлороформом, тетрахлоридом углерода);
- вирусном гепатите [12].
5.6. Глюкоза
Содержание глюкозы в крови является основным показателем углеводного обмена.
Определение глюкозы в крови по цветной реакции с ортотолуидином.
Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы.
Реактивы: 1) орготолуидиновый реактив (0,15 г ти- омочевины растворяют в 94 мл ледяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл бесцветного или слегка желтоватого ортотолуидина; ортотолуидин очищают путем перегонки; реактив стоек, хранят на холоду);
3% раствор трихлоруксусной кислоты;
стандартный раствор глюкозы 5000 мг/л (в мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 500 мг высушенной до постоянной массы при температуре 100°С глюкозы в 0,2% растворе бензойной кислоты; для приготовления раствора бензойной кислоты отвешивают 0,2 г кристаллической бензойной кислоты и растворяют ее в небольшом количестве дистиллированной воды, которую нагревают на водяной бане до полного исчезновения кристаллов; после охлаждения до комнатной температуры раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, и доливают до метки дистиллированной водой; хранят в холодильнике).
В качестве материала для исследования используют кровь с положительной качественной пробой на глюкозу. Ход определения. В пробирку наливают 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдувают (на ее стенку) 0,1 мл крови. Встряхивают и центрифугируют. К 0,5 мл центрифугата добавляют 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Пробирку со смесью помещают в кипящую водяную баню на 8 мин (точно), вынимают, охлаждают под водопроводной водой до комнатной температуры. Экстинкцию измеряют на ФЭКе при длине волны 590— 650 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля.
Контроль. 0,5 мл трихлоруксусной кислоты и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.
Стандартная проба. Ставят как опытную, но вместо сыворотки берут стандартный раствор глюкозы с концентрацией 1000 мг/л (3000 или 5000 мг/л в случае высокого содержания глюкозы в крови).
Расчет ведут по формуле:
Соп=Сст*(Еоп/Ест),
где Соп—концентрация глюкозы в крови, мг/л; Сст— концентрация глюкозы в стандарте, мг/л; Еоп — экстинкция пробы; Ест —экстинкция стандарта. Коэффициент перечета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,00555.
Нормальные величины: пуповинная кровь — 2,5-5,3 ммоль/л; недоношенные — 1,1-3,33 ммоль/л; новорожденные 1 день — 2,22 - 3,33 ммоль/л;1 мес — 2,7-4,44 ммоль/л; дети старше 5-6 лет — 3,33-5,55 ммоль/л; взрослые до 60 лет — 4,44-6,38 ммоль/л; старше 60 лет — 4,61-6,10 ммоль/л.
Снижение содержания глюкозы ниже 3,3 ммоль/л у взрослых — гипогликемия, повышение более 6 ммоль/л — гипергликемия [12].
Повышение содержания:
физиологическая гипергликемия - алиментарная, эмоциональная;
при сахарном диабете (при условии содержания глюкозы натощак 7 ммоль/л и более и дневных колебаний после приема пищи до 11 ммоль/л); при подозрении на сахарный диабет и в группах риска проводят дополнительное исследование — глюкозотолерантный пероральный тест — ОПТ (сахарная кривая);
при гипертиреозе;
при адренокортицизме;
при гиперпитуитаризме.
Снижение содержания:
длительное голодание;
нарушение всасывания (заболевания ЖКТ), хронические заболевания печени (нарушения синтеза гликогена);
нарушение секреции контринсулярных гормонов — гипопитуитаризм, хроническая недостаточность коры надпочечников;
гипотиреоз;
заболевания ЦНС — инсульты;
передозировка инсулина и пероральных диабетических средств;
нарушение режима питания у больных с сахарным диабетом;
заболевания поджелудочной железы (инсулинома).
5.7. Липиды плазмы крови
В крови присутствуют липиды четырех основных групп:
холестерин и его эфиры;
триглицериды;
фосфолипиды;
неэтерифицированные жирные кислоты [11].
Липиды первых трех классов образуют комплексы с белками (аиопротеидами) и входят в состав липопротеидов.
Холестерин (ХС) выполняет две главные функции — структурную и метаболическую.
Структурная функция — ХС является компонентом плазматической мембраны, влияет на ее физико-химические свойства, регулирует проницаемость, активность ферментов мембран.
Метаболическая функция — ХС является предшественником ряда биологически активных веществ — стероидных гормонов, витаминов группы D, желчных кислот.
Источником ХС являются пища и эндогенный синтез из АцКоА в печени и, частично, в кишечнике. Транспортируется ХС в составе липопротеиновых комплексов: из печени в ткани в составе ЛПНП. Избыток ХС из тканей удаляется ЛПВП в печень, где ХС окисляется в желчные кислоты.
Определение общего холестерина в сыворотке крови.
Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание.
Реактивы: 1) смесь из 1 части ледяной уксусной кислоты, 5 частей уксусного ангидрида и 1 части концентрированной серной кислоты; процесс смешивания идет с выделением тепла, поэтому сначала смешивают уксусную кислоту с уксусным ангидридом, а затем, при постоянном охлаждении, помешивая, медленно добавляют серную кислоту; полученная смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой; хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в холодильнике;
2) стандартный раствор холестерина—1800 мг/л (180 мг холестерина растворяют в 2,5 мл хлороформа в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят до метки абсолютным спиртом); раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой, которую парафинируют; 1 мл раствора содержит 1,8 мг холестерина.
Ход определения. К 2,1 мл смеси реактивов (1) добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки. Добавляют медленно, так, чтобы сыворотка стекала по стенке пробирки. Пробирку энергично встряхивают 10—12 раз и помещают в термостат иа 10 мин при температуре 37° С. Измерения производят на ФЭКе против реактива 1 при красном светофильтре (630—690 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора холестерина (2) готовят ряд разведений.
Рабочие стандартные растворы обрабатывают так же, как опытные пробы.
Нормальные величины зависят от возраста: Новорожденные - 1,3-2,6 ммоль/л; 1 год - 1,82-4,94 ммоль/л; 2-14 лет - 3,74-6,50 ммоль/л; взрослые - 3,9-7,2 ммоль/л.
Повышение содержания ХС:
атеросклероз;
сахарный диабет;
заболевания печени;
наследственная гиперхолестеринемия.
Понижение содержания ХС:
тиреотоксикоз;
кахексия;
острый панкреатит.
Вероятность развития атеросклероза прогнозируется индексом атерогенности (Ка), который рассчитывают по формуле:
Ка=(ХСобщ-ХСЛПВП)/ ХСЛПВП
Величина этого коэффициента зависит от возраста: в 20-30 лет — 2,5;
в 40-60 лет — 3,0-3,5 (без клинических проявлений атеросклероза).
У лиц с ишемической болезнью сердца индекс атерогенности больше 4,0.
Количественные изменения ХС в составе ЛПНП (ЛПНП-хол) в зависимости от возраста: пуповинная кровь— 0,2-1,3 ммоль/л; до 19 лет — 1,55-3,89 ммоль/л; 20-39 лет — 1,55-4,1 ммоль/л; 40-49 лет — 2,07-4,92 ммоль/л; 50-59 лет — 2,33-5,70 ммоль/л; 60-69 лет — 2,59-6,09 ммоль/л; старше 70 лет — 2,46-5,57 ммоль/л.
Обычные пределы для взрослых: 1,68-4,53 ммоль/л.
Количественные изменения ХС в составе ЛПВП: 0 -14 лет — 0,13-1,3 ммоль/л; 15 -30 лет — 0,78-1,85 ммоль/л; 30-39 лет — 0,78-2,07 ммоль/л; старше 40 лет — 0,78-2,20 ммоль/л.
В клинических лабораториях содержание ЛПНП-хол часто определяют путем вычисления, используя величины общего ХС, ЛПВП-хол и триглицеридов (ТГ).
ЛПНП-хол = ХСобщ -ЛПВП-хол - ЛПНОП-хол, где
ЛПНОП-хол (мг/100мл) = ТГ/5 , или ЛПНОП-хол (ммоль/л) = ТГ/2,18.
Существует положительная связь между ишемической болезнью сердца и содержанием ЛПНП-хол.
Липопротеиды.
Различают следующие группы липопротеидов:
хиломикроны, богатые триглицеридами; состоят из триглицеридов (80-95%), холестерина (0,5-3%), фосфолипидов (3-9%), белка (1-2%);
липопротеиды низкой плотности (ЛГ1НП); состоят из триглицеридов (24-34%), холестерина (35-45%), фосфолипидов (11-17%), белка (14-18%);
липопротеиды высокой плотности (ЛПВП); состоят из триглицеридов (3-5%), холестерина (20-37%), фосфолипидов (24-40%), белка (45-55%);
липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП): состоят из триглицеридов (50-70%), холестерина (15-17%), фосфолипидов (13-20%), белка (5-12%) [15].
Липопротеиды высокой плотности (ЛПВП, α-липо- протеиды).
Нормальные величины: новорожденные — 0,7-1,8 г/л; дети до 1 года — 0,8-2,8 г/л; подростки и взрослые — 1,5-3,3 г/л.
Повышение содержания наблюдается при хроническом алкоголизме.
Снижение содержания наблюдается;
при обтурационной желтухе, тяжелых заболеваниях печени;
при лимфогранулематозе, парентеральном питании
ЛПВП переносят жирные кислоты, ХС, фосфолипиды, триглицериды. Гипер-α-липопротеинемия является защитным фактором от поражения венечных артерий сердца (отрицательный фактор риска).
Липопротеиды низкой плотности (ЛПНП, β -липопротеиды).
Нормальные величины составляют 28-53% от всех липопротеидов.
Повышение содержания наблюдается при гиперлипопротеинемии III типа, первичной семейной гиперхолистеринемии, гиперкортицизме, сахарном диабете, гипотиреозе.
Понижение содержания наблюдается при синдроме мальабсорбции, муковисцидозе, тяжелом голодании.
Пре-β-липопротеиды (ЛПОНП).
Нормальные величины: до 20 лет — 200-250 мг/л; 20-29 лет — 250-300 мг/л; 30-39 лет — 300-450 мг/л; 40-49 лет — 300-400 мг/л; 50-59 лет — 400-500 мг/л; 60-69 лет — 350-400 мг/л; старше 70 лет — 300-400 мг/л.
Триглицериды.
Нормальные величины: до 5 лет — 0,1—1,11 ммоль/л; 6-11 лет — 0,36-1,12 ммоль/л; 12-15 лет — 0,4-1,56 ммоль/л; 15-29 лет — 0,45-1,45 ммоль/л; 30-39 лет —0,43-1,81 ммоль/л; 40-49 лет — 0,5-2,1 ммоль/л; 50-59 лет — 0,62-2,79 ммоль/л.
Обычные показатели для взрослых: мужчины — 0,45-1,81 ммоль/л; женщины — 0,40-1,53 ммоль/л.
Повышение содержания наблюдается при гиперли- попротеинемии I, II, III, IV, V типов, вирусном гепатите, алкоголизме, остром и хроническом панкреатите, хронической почечной недостаточности, гипертонической болезни, инфаркте миокарда, гипотиреозе, гликогенозах I, III и VI типов, сахарном диабете, подагре.
Понижение содержания наблюдается при гиполипопротеннемии и абеталипопротеинемии, хронических заболеваниях легких, гипертиреозе, гиперпаратиреозе, синдроме мальабсорбции.
Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по содержанию фосфора.
Фосфолипиды осаждаются трихлоруксусной кислотой вместе с белками крови. Осадок подвергают минерализации с помощью раствора хлорной кислоты. Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую кислоту, которая восстанавливается эйкогеном (аминонафтосульфоновая кислота) и бисульфитом натрия в молибденовую синь. По интенсивности окраски судят о количестве неорганического фосфора.
Реактивы: 1) 10% раствор трихлоруксусной кислоты;
80% (800 г/л) раствор хлорной кислоты (относительная плотность 1,5);
4% раствор молибдата;
основной раствор аминонафтолсульфоновой кислоты— эйкогена;
основной стандартный раствор однозамещенного фосфорнокислого калия, высушенного до постоянной массы при температуре 120° С;
рабочий стандартный раствор готовят разведением основного стандартного раствора в 100 раз; 1 мл его содержит 0,01 мг фосфора; оба раствора хранят в холодильнике.
Ход определения. 0,2 мл сыворотки помещают в пробирку, содержащую 3 мл воды. Добавляют 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты: первые 1,5 мл по каплям, остальное сразу. Оставляют стоять не более 1—2 мин, затем центрифугируют 3—5 мин. Надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют 1 мл 80% раствора HC104 и для равномерного кипения 1—2 бусинки. Пробирку нагревают 20—30 мин на песочной бане (температура 180° С) пока смесь не станет бесцветной. После охлаждения добавляют дистиллированную воду до объема 7 мл.
Контрольная проба. 0,8 мл 80% раствора хлорной кислоты доводят водой до объема 7 мл.
Стандартные пробы. Готовят 3 пробирки. Берут по 2 мл рабочего стандартного раствора и 0,8 мл 80% раствора хлорной кислоты. Все пробы доводят до объема 7 мл дистиллированной водой.
Для определения фосфора пробирки располагают в следующем порядке: контрольная, 2 стандартные, опытная, стандартная. В каждую прибавляют по 1 мл 4% молибдата аммония, перемешивают и прибавляют до 1 мл раствора эйкогена, доводят объем до 10 мл водой. Снова перемешивают. Через 20 мин после прибавления эйкогена производят измерения на ФЭКе при красном светофильтре (630—690 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля.
Расчет ведут по формуле:
Липидный фосфор=(Еоп/Ест)*(0,02*1000:0,2)= Еоп/Ест*100 мг/л,
где 0,02—содержание фосфора в 2 мл стандарта, мг; 0,2—количество взятой сыворотки, мл; 1000— коэффициент пересчета из 1 мл в 1 л.
В норме концентрация липоидного фосфора составляет 1,97 —4,68 ммоль/л (61 —145 мг/л). Концентрация общих фосфолипидов вычисляется умножением полученного липоидного фосфора на 25 [12].
5.8. Неорганические вещества крови
Кальций.
Нормальные величины: общее содержание составляет 2,3-2,75 ммоль/л; ионизированный кальций — 1,05-1,3 ммоль/л.
Определение кальция в сыворотке крови с применением мурексида.
Свободный мурексид в щелочной среде имеет сине-фиолетовый цвет, а связанный в комплекс с кальцием - розово-оранжевый. При титровании раствором более сильного комплексообразователя (комплексон III) этот комплекс разрушается, и связанный с кальцием мурексид освобождается. Проба приобретает фиолетовый цвет.
Реактивы: 1) раствор комплексона III (1,665 комплексона III вносят в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят дистиллированной водой до метки);
9 н. раствор едкого натра (36 г щелочи растворяют в небольшом объеме воды, переносят в колбу вместимостью 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки);
мурексид, смешанный с хлоридом натрия в соотношении 1:50 и растертый в тонкий порошок; хранят в полиэтиленовой посуде.
Ход определения. В маленькую коническую колбу вносят 50 мл дистиллированной воды, 0,4 мл 9 н. раствора щелочи и прибавляют на кончике ножа смесь мурексида. Появляется сине-фиолетовое окрашивание свободного мурексида. Жидкость делят пополам: одна часть раствора служит эталоном окраски («свидетель»), другая - используется для опытной пробы. К ней добавляют 1 мл сыворотки крови, появляется розово-оранжевое окрашивание. Раствор тотчас титруют комплексоном III до сине-фиолетового окрашивания (сравнивают с окраской «свидетеля»). Расчет производят по формуле: ,
х = а *1,8,
где х—концентрация кальция, ммоль/л; 1,8 — фактор пересчета, соответствующий концентрации комплексона а - количество комплексона, мл.
Понижение содержания кальция вызывают:
— беременность;
алиментарные дистрофии;
рахит у детей;
острый панкреатит (снижение концентрации кальция менее 1,74 ммоль/л— плохой прогностический признак);
стеаторея при панкреатитах, закупорке желчевыводящих путей;
почечная недостаточность;
вливание больших количеств цитратной крови [22].
Повышение содержания кальция (гиперкальциемия) вызывают:
повышение функции паращитовидных желез;
переломы костей;
полиартриты;
метастазы злокачественных опухолей в кости;
множественные миеломы;
передозировка витамина D и кальция;
желтухи (в большей мере механическая);
саркоидоз Бенье — Бека — Шауманна.
Хлориды.
Нормальные величины: 96-109 ммоль/л [4].
Определение ионов хлора в сыворотке крови, моче и спинномозговой жидкости меркуриметрическим методом с индикатором дифенилкарбазоном.
Ионы хлора в биологических жидкостях титруют нитратом ртути, применяя в качестве индикатора дифенилкарбазон. В эквивалентной точке избыток нитрата ртути образует с индикатором комплекс, окрашенный в сине-фиолетовый цвет.
Реактивы: 1) раствор нитрата ртути (2 г двухвалентного нитрата ртути х. ч. растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 20 мл 2 н. раствора азотной кислоты и доводят объем водой до 1 л); реактив стойкий;
раствор индикатора (100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96% этанола; раствор хранят в холодильнике в течение месяца);
2 н. раствор азотной кислоты (14 мл концентрированной азотной кислоты доводят до объема 100 мл дистиллированной водой);
0,01 н. стандартный раствор хлора (584,5 мг хлорида натрия х. ч. высушенного до постоянной массы при 120° С, доводят до объема 1 л дистиллированной водой; 1 мл раствора содержит 0,01 ммоль/л хлора).
Ход определения. В «сахарный» стакан отмеривают 1,8 мл дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, 4 капли индикатора и титруют нитратом ртути из микробюретки до появления сине-фиолетового окрашивания. Для стандартизации раствора нитрата ртути к 2 мл стандартного раствора хлорида натрия добавляют 4 капли индикатора и титруют раствором нитрата ртути как опытную пробу. Расчет производят по формуле:
Х=(0,02*А*5*1000)/Б=(А*100)/Б,
где х—количество ионов хлора, ммоль/л; 0,02 — количество хлора в 2 мл стандартного раствора, ммоль/л; 5*1000 — коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости; А—количество раствора нитрата ртути, израсходованного на титрование опыта, мл; Б—количество раствора нитрата
Потеря хлоридов ведет к развитию алкалоза, избыток — к ацидозу. Хлориды (преимущественно хлорид натрия) регулируют осмотическое давление жидких сред организма.
Понижение содержания хлоридов (гипохлоремия) вызывают:
повышенное выделение хлоридов из организма (работа в горячих цехах, в жарком климате, при лихорадочных состояниях — выделение с потом);
диарея, частые рвоты;
респираторный и метаболический ацидоз;
частые зондирования, непроходимость кишечника;
недостаточность функции надпочечников. Повышение содержания хлоридов имеет место при:
почечной недостаточности;
гиперпаратиреозе;
дегидратации.
5.9. Ферменты крови
Аминотрансферазы.
Аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ).
Аминотрансферазы играют центральную роль в обмене белков и взаимосвязи с обменом углеводов. Небелковой частью этих ферментов является витамин В6(фосфопиридоксаль). Избирательная тканевая специализация позволяет считать их маркерными ферментами — АлАТ — для печени, АсАТ — для миокарда. Они относятся к индикаторным ферментам, активность ко- торых повышается при повреждении ткани за счет гибели, разрушения клеток и выхода фермента в циркулирующую кровь [17].
Нормальные величины:
АлАТ — 0,1-0,68 мкмоль/(мл ч) или 28- 190 нмоль/(с л);
АсАТ — 0,1-0,45 мкмоль/(мл ч) или 28- 125 нмоль/(с л), колориметрический метод Райтмана — Френкеля;
оптический тест — 2-25 ME при 30°С.
Определение активности α-амилазы.
Крахмал в присутствии ионов йода окрашивается сине-фиолетовый цвет. α-Амилаза осуществляет расщепление крахмала с образованием продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности фермента судят по уменьшению концентрации крахмала.
Реактивы: 1) субстратно-буферный раствор, pH 7,0 (13,3 г безводного двузамещенного фосфата натрия и 4,3 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл дистиллирован ной воды, доводят до кипения; 0,2 г растворимого крахмала размешивают в небольшом количестве воды и выливают при перемешивании в кипящую смесь, кипятят 1 мин, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимость 500 мл и доводят дистиллированной водой до метки);
0,1 н. основной раствор йода (готовят из фиксанала);
0,01 н. рабочий раствор йода (готовят из 0,1 н. раствора перед работой).
Ход определения. В мерную колбу вместимость 50 мл помещают 5 мл субстратно-буферного раствора нагревают 5 мин при 37° С, добавляют 0,1 мл сыворотки. Инкубируют 7,5 мин при температуре 37° С. Сразу же добавляют 5 мл рабочего раствора йода, доводят объем дистиллированной водой до 50 мл. Тотчас измеряют экстинкцию на ФЭКе в кювете с толщиной ело 10 мм при красном светофильтре (630—690 нм) против воды.
Контрольную пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют вместе с рабочим раствором йода после инкубации. Измерение экстинкции проводят также как в опытной пробе.
Расчет. Активность -амилазы выражают в грамм крахмала, расщепленного 1 л сыворотки (или мочи) за 1 ч инкубации при 37° С. Расчет производят по формуле:
Х=(Ек-Еоп)/Ек*2*8*10=(Ек-Еоп)/Ек*160,
где х—активность амилазы; Ек — экстинкция контрольной пробы; Еоп—экстинкция опытной пробы; 2 — количество крахмала, введенное в пробу, мг; 8 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; 10—коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки или мочи.
Полученный ответ в мг/(ч*мл) численно равен ответу в г/(ч*л).
В норме активность α-амилазы в сыворотке крови — 12—32 г/(ч*л), в моче 20—160 г/(ч*л).
Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови.
Аланинаминотрансфераза катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы с DL-аланина на -кетоглутаровую кислоту с образованием пировиноградной и L-глутаминовой кислот. Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде с образованием динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты. По количеству образованной пировиноградной кислоты судят об активности АлАТ.
Реактивы: 1) 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,4 (предварительно готовят 2 раствора: а) 17,4 двузамещенного фосфата натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; б) 13,6 г однозамещенного фосфата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для получения буферного раствора смешивают 840 мл раствора а и 160 мл раствора б; полученный раствор должен давать с индикатором бромтимоловым синим голубую окраску);
субстратный раствор (29,2 мг α -кетоглутаровой кислоты и 1,78 г DL-аланина отвешивают на аналитических весах, растворяют в 1н. растворе едкого натра, добавляя его небольшими порциями до полного растворения навесок и получения pH 7,4; раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, ополаскивают посуду, в которой растворялись навески, 0,1 М фосфатным буфером и доливают им до метки; приготовленный раствор тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлороформа); хранят в холодильнике в замороженном виде;
раствор 2,4-динитрофенилгидразина (19,8 мг сухого вещества растворяют в небольшом количестве 1 н. раствора хлористоводородной кислоты при нагревании на водяной бане в мерной колбе вместимостью 100 мл; после охлаждения доводят объем хлористоводородной кислотой до метки); фильтруют через 24 ч, хранят в склянке темного стекла в холодильнике;
0,4 н. раствор едкого натра;
стандартный раствор пирувата натрия (11 мг кристаллического пирувата натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки водой); 1 мл раствора содержит 110 мкг пировиноградной кислоты; раствор используют для построения калибровочного графика.
Ход определения. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора и нагревают при 37° С в течение 5 мин. Добавляют 0,1 мл сыворотки и помещают в термостат при 37° С на 30 мин. Затем вносят 0,5 мл раствора динитрофенилгидразина, оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Приливают 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра, тщательно перемешивают, оставляют для развития окраски на 10 мин при комнатной температуре.
Экстинкцию измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром (530 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля. Контроль ставят как опыт, но раствор динитрофенилгидразина добавляют до инкубации.
Расчет активности фермента производят по калибровочному графику, показывающему зависимость оптической плотности от содержания пировиноградной кислоты.
Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений. В пробирку с разведенным пируватом натрия прибавляют по 0,5 мл раствора динитрофенилгидразина, далее пробы обрабатывают как опытные. Измеряют экстинкцию на ФЭКе при тех же условиях, что и опыт, но вместо контроля используют дистиллированную воду.
Пересчет активности АлАТ в микромоли пировиноград- ной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 л сыворотки в течение 1 ч, производят по калибровочному графику или по формуле:
АлАТ=С*2*10:88,
где С - пировиноградная кислота, найденная по калибровочному графику, мкг; 10 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 2 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; 88 — масса 1 мкмоля пировиноградной кислоты, мкг.
Активность АлАт повышается при заболеваниях печени, особенно при инфекционном гепатите (в инкубационном периоде). Активность АсАТ в 2-20 раз повышается при инфаркте миокарда, и этот показатель имеет прогностическое значение: если на 4-й день болезни активность АсАТ не снижается, то это плохой прогностический признак. При стенокардии активность АсАТ не изменяется. При инфаркте миокарда может быть одновременное повышение активности АлАТ [22].
Диагностически ценным является определение активности АлАТ и АсАТ одновременно и расчет коэффициента де Ритиса — АсАТ/АлАТ. В норме этот коэффициент равен 1,3. При инфекционном гепатите он ниже, при инфаркте миокарда выше.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключении вышепредставленной курсовой работы можно сделать следующий вывод:
Важное значение в развитии стресс-индуцированной альтерации тканей и органов имеет подавление стрессом эритропоэза и снижение ОРЭ, что приводит к гипоксии клеток и тканей в условиях стресса и является одним из механизмов стрессорных повреждений внутренних органов. Глицин и превентивное введение комплекса стресс-лимитирующих веществ успешно предотвращают этот эффект стресса, улучшая снабжение клеток и тканей кислородом, и повышая, таким образом, их резистентность к стрессорным повреждениям.
Многими авторами, начиная с работ Г.Селье, описаны многообразные повреждения клеток, тканей и органов, вызванные стрессом. При этом в очагах повреждений развивается нейтрофильная инфильтрация. В связи с этим в организме возникает высокая потребность в нейтрофилах. При стрессе происходит дефицит нейтрофилов в организме. Вследствие этого, воспалительный процесс в условиях стресса может приобретать затяжной характер, что также является одним из механизмов снижения резистентности организма. Дефицит нейтрофилов при стрессе успешно предупреждается введением даларгина, а-токоферола и пролонгированной комплексной терапией.
Одним из признаков стресса является развитие эозинопении, что объясняют двумя возможными причинами: выселением эозинофилов в ткани и их разрушением под действием высоких доз глюкокортикоидных гормонов. В тканях эозинофилы инактивируют гистамин, ограничивая, таким образом, его эффекты (микроотеки, сокращение гладких миоцитов и другие), в том числе, обусловленные гистамином аллергические реакции.
В условиях стресс-реакции эозинопения сопровождается практически полным опустошением костномозгового резерва эозинофилов, следовательно, в организме возникает дефицит этих клеток. Ослабление антиаллергических эффектов эозинофилов в результате их дефицита в условиях стресса приводит к развитию аллергических реакций и замедлению заживления ран, что подтверждается результатами исследований таких авторов как Маслов Л.Н., Кривоногов Н.Г., Лишманов Ю.Б.
Лимфоциты, в силу специфичности их функций и гетерогенности субпопуляционного состава, проходят в организме самый сложный путь пролиферации и дифференцировки. В периферической крови в норме преобладают лимфоциты СД4+ с хелперной функцией, и лишь около одной трети составляют зрелые лимфоциты-памяти и мигрирующие в периферические лимфоидные органы лимфоциты тимуса и костного мозга. Таким образом, развивающийся в условиях стресса лимфоцитоз, вероятно, означает выброс в кровь тимусных и костномозговых лимфоцитов, которые должны заселить Т- и В-зоны в периферических лимфоидных органах. Этим же частично объясняется и акцидентальная инволюция тимуса при стрессе. Следовательно, лимфоцитоз и стимуляция лимфопоэза в костном мозге при стрессе свидетельствуют об увеличении активности антигеннезависимого этапа лимфопоэза. Антигензависимый этап лимфопоэза в условиях стресса, наоборот, угнетается, о чем свидетельствует инволюция белой пульпы селезенки. Дисбаланс между антигеннезависимой и антигензависимой пролиферацией и дифференцировкой лимфоцитов при стрессе приводит к нарушению иммунных реакций, развитию аллергии и т.п.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ
Абдулкадыров К.М. Гематология. Новейший справочник /К. М. Абдулкадыров Ю.А. Криволапов, И.С. Мартынкевич, С.И. Моисеев и др. – М.: Сова, 2004. – 928 с.
Атлас гематологии Андерсон Ш.К. Изд-во: Логосфера 2007. С. 55.
Братчик А.М. Клинические проблемы фибриолиза. – Киев: Здоровье, 1993. – 344 с.
Бяловский Ю.Ю. Анализ гемограмм: теория и практика / Ю.Ю. бяловский, В.И. Глобин. – Рязань: Информационные технологии, 1999. – 84 с.
Введение в клеточную биологию. Ченцов Ю.С. , М. 2004
Галактионов В.Г. «Иммунологический словарь», М., ACADEMIA, 2005.
Гаркави Л. Х. Активационная терапия. - Ростов н/Д: Изд-во Рост. ун-та. - 2006. С. 52
Гаркави Л. Х., Квакина Е. Б., Кузьменко Т. С., Шихлярова А. И. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Ч.2 - Екатеринбург: «Филантроп». - 2003. - 336 с.
Гематология: Новейший справочник Авторы: Под общ. ред. К. М, Абдулкадырова. Город: М 2004
Горизонтов П.Д., Белоусова О.И. и Федотова М.И. Стресс и система крови, М., 1983
Долгов, В.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза /В.В. Долгов, П.В. Свирин. – Тверь: Триада, 2005. – 227 с.
Заболевания крови Автор: Дроздова М.В. Издательство: Свет. Звезда 2009
Земсков А.М., Земсков В.М., Караулов А.В. «Клиническая иммунология» М., 2006.
Интернет сайт «muldyr.ru» [Электронный ресурс]: Режим доступа:www.muldyr.ru/a/a/nespetsificheskie_adaptatsionnyie_reaktsii_organizma_-_teoriya_nespetsificheskih_adaptatsionnyih_reaktsiy_organizma
Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Название: Лабораторная гематология Изд-во: Триада 2006.
Мамаев Н.Н. Гематология: руководство для врачей / Н.Н. Мамаев. - СПб.: СпецЛит, 2008. - 543 с.
Мамаев Н.Н., Рябов С.И. Гематология М.: Изд-во: СпецЛит. 2008. С. 99.
Медицинская энциклопедия Электронная версия [Электронный ресурс]: Режим доступа:www.dic.academic.ru/dic.nsf/dic_biology/2701/КРОВЬ
Медицинская энциклопедия Электронная версия [Электронный ресурс]: Режим доступа: www. http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_medicine /1425/Адаптационная
Список литературы [ всего 25]
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ
1.Абдулкадыров К.М. Гематология. Новейший справочник /К. М. Абдулкадыров Ю.А. Криволапов, И.С. Мартынкевич, С.И. Моисеев и др. – М.: Сова, 2004. – 928 с.
2.Атлас гематологии Андерсон Ш.К. Изд-во: Логосфера 2007. С. 55.
3.Братчик А.М. Клинические проблемы фибриолиза. – Киев: Здоровье, 1993. – 344 с.
4.Бяловский Ю.Ю. Анализ гемограмм: теория и практика / Ю.Ю. бяловский, В.И. Глобин. – Рязань: Информационные технологии, 1999. – 84 с.
5.Введение в клеточную биологию. Ченцов Ю.С. , М. 2004
6.Галактионов В.Г. «Иммунологический словарь», М., ACADEMIA, 2005.
7.Гаркави Л. Х. Активационная терапия. - Ростов н/Д: Изд-во Рост. ун-та. - 2006. С. 52
8.Гаркави Л. Х., Квакина Е. Б., Кузьменко Т. С., Шихлярова А. И. Антистрессорные реакции и активационная терапия. Ч.2 - Екатеринбург: «Филантроп». - 2003. - 336 с.
9.Гематология: Новейший справочник Авторы: Под общ. ред. К. М, Абдулкадырова. Город: М 2004
10.Горизонтов П.Д., Белоусова О.И. и Федотова М.И. Стресс и система крови, М., 1983
11.Долгов, В.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза /В.В. Долгов, П.В. Свирин. – Тверь: Триада, 2005. – 227 с.
12.Заболевания крови Автор: Дроздова М.В. Издательство: Свет. Звезда 2009
13.Земсков А.М., Земсков В.М., Караулов А.В. «Клиническая иммунология» М., 2006.
14.Интернет сайт «muldyr.ru» [Электронный ресурс]: Режим доступа:www.muldyr.ru/a/a/nespetsificheskie_adaptatsionnyie_reaktsii_organizma_-_teoriya_nespetsificheskih_adaptatsionnyih_reaktsiy_organizma
15.Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Название: Лабораторная гематология Изд-во: Триада 2006.
16.Мамаев Н.Н. Гематология: руководство для врачей / Н.Н. Мамаев. - СПб.: СпецЛит, 2008. - 543 с.
17.Мамаев Н.Н., Рябов С.И. Гематология М.: Изд-во: СпецЛит. 2008. С. 99.
18.Медицинская энциклопедия Электронная версия [Электронный ресурс]: Режим доступа:www.dic.academic.ru/dic.nsf/dic_biology/2701/КРОВЬ
19.Медицинская энциклопедия Электронная версия [Электронный ресурс]: Режим доступа: www. http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_medicine /1425/Адаптационная
20.Медицинский сайт «Градусник.ру» [Электронный ресурс]: Режим доступа:www. gradusnik.ru/rus/medall/analiz/kch/
21.Молекулярная биотехнология. Принципы и применения Б. Глик, Дж. Пастернак 2002
22.Петрищев Н.Н., Афанасьев Б.В. Патофизиология системы крови Изд-во: СПбГМУ, 2006.
23.Радченко В.Г. Основы клинической гематологии / В.Г. Радченко. – СПб.: Диалект, 2003. – 304 с.
24.Селье Г. Стресс без дистресса. – Рига, 2007.
25.Яричин А.А. Прикладная кинезиология с точки зрения неспецифических адаптационных реакций // «Прикладная кинезиология».-№2 (3).-2003.- С14-16.
Пожалуйста, внимательно изучайте содержание и фрагменты работы. Деньги за приобретённые готовые работы по причине несоответствия данной работы вашим требованиям или её уникальности не возвращаются.
* Категория работы носит оценочный характер в соответствии с качественными и количественными параметрами предоставляемого материала. Данный материал ни целиком, ни любая из его частей не является готовым научным трудом, выпускной квалификационной работой, научным докладом или иной работой, предусмотренной государственной системой научной аттестации или необходимой для прохождения промежуточной или итоговой аттестации. Данный материал представляет собой субъективный результат обработки, структурирования и форматирования собранной его автором информации и предназначен, прежде всего, для использования в качестве источника для самостоятельной подготовки работы указанной тематики.
bmt: 0.00537