Сравнительное изучение различных методов окраски спор бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1.Споры и их функция в жизненном цикле микроорганизмов
1.2. Эндоспоры
1.3.Экзоспоры
2. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1.Изготовление мазка
2.2.Окраска эндоспор
2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе
2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера
2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона
2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)
2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера
2.3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

После этого из культуры взяли каплю материала. Петлю вынесли из пробирки, пробирку закрыли в пламени спиртовки и поместили в штатив.
Взятый из культуры материал нанесли на обезжиренное предметное стекло и распределили по нему. Обезжиривание стекла производили непосредственно перед работой. Для этого участок стекла, на который впоследствии был нанесён препарат, обработали мылом и протерли марлей. Для полного обезжиривания можно так же прожигать стёкла в пламени горелки. После нанесения препарата на стекло оставшиеся на микробиологической петле организмы были уничтожены. Это было произведено путём однократной стерилизации петли в пламени спиртовки.
2.2.Окраска эндоспор
2.2.1.Окрашивание эндоспор по методу Вайсера—Хьюппе
Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
Раствор карболового фуксина
Для приготовления 1 г основного фуксина растворить в 2 мл глицерина и долить до 100 мл 5 % раствором фенола.
Так же можно применить следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.
2,5% раствор серной кислоты
96° раствор этилового спирта
Раствор метиленового синего
Вода
Термостат 37 °С
Ход работы:
Был приготовлен мазок препарата, как описано выше.
На мазок было нанесено несколько капель раствора карболового фуксина (можно использовать фуксин на анилиновой воде), окрашивание проводилось в термостате при 37 °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.
Препарат обесцвечивали 2,5 % раствором серной кислоты в течение 3 — 5 с и сполоснули 96 % спиртом, до тех пор, пока в раствор не перестали переходить облачка красителя.
Препарат был докрашен метиленовым синим в течение 3 — 5 мин.
После докрашивания препарат ополоснули в проточной воде и высушили на воздухе. Микроскопию проводили при масляной иммерсии.
Возможна модификация процесса на стадии окрашивания фуксином, позволяющая ускорить процесс приготовления препарата. В этом случае окрашивание производится только карболовым фуксином. Мазок, покрытый красителем, следует подогревать на огне до появления паров в течение 5 — 8 мин. При использовании данного подхода обесцвечивание проводится 10 – 20 секунд в 2,5 % серной кислоте.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в красный цвет, бактерии – в синий.
2.2.2.Окрашивание эндоспор по методу Меллера
Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
5% водный раствор хромовой кислоты
Раствор карболового фуксина
5% раствор серной кислоты
Раствор метиленового синего
Вода
Газовая горелка
Ход работы:
Зафиксированные мазки были помещены на 2 минуты в хлороформ.
Обработанные таким образом мазки были перенесены в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 — 10 минуты.
Препарат был промыт в проточной воде и окрасить карболовым фуксином. Для этого на стекло нанесли несколько капель красителя. Окрашивание проводили в течение 1 минуты (стекло при этом подогревали на горелке до появления паров).
Препарат был обесцвечен в 5 % растворе серной кислоте в течение 5 с.
Препарат тщательно промыли в проточной воде и подкрасили водным раствором метиленового синего в течение 3 минут.
Препарат промыли в проточной воде ещё раз и высушли на воздухе
Микроскопию препарата проводили при масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры приобрели красный цвет, вегетативные клетки бактерий окрасились в синий.
2.2.3. Окрашивание эндоспор малахитовым зеленым по методу Шеффера-Фултона
Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
1% водный раствор сафранина
5% раствор малахитового зелёного
Вода
Спиртовка
Ход работы:
Мазки культуры были зафиксированы над огнем.
Препарат был окрашен 5 % водным раствором малахитового зеленого в течение 5—10 мин.
Препарат промывали в проточной воде.
Было произведено докрашивание препарата 1 % водным раствором сафранина в течение 30 с.
Стекло промыли водой, и высушили на воздухе
Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Эндоспоры окрасились в зелёный цвет, клетки бактерий – в красный (препарат окрашенный по этой методике представлен на рис 3).
Рисунок 3. Bacillus subtillus, окраска по Шефферу-Фултону
2.2.4.Окрашивание эндоспор по методу Ожешки (Ауески)
Необходимое оборудование и реактивы:
Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
0,5 % раствор соляной кислоты
Фильтровальная бумага
Раствор карболового фуксина
1% солянокислый спирт
Метиленовым синий Лефлера
Вода
Спиртовка
Ход работы:
Для работы был приготовлен мазок культуры. Для дальнейшей работы использовался нефиксированный мазок.
На мазок налили 0,5 % раствор соляной кислоты и подогрели стекло над огнем 1 — 2 минуты. Затем слили с препарата кислоту и тщательно промыть проточной водой, высушить на воздухе.
После высыхания мазок был зафиксирован в пламени. Фиксированный препарат окрашивали по методу Циля — Нильсена, описанному ниже.
Этот метод применяется для окраски кислотоустойчивых бактерий, в том числе микобактерий туберкулёза.
Налили на фиксированный мазок карболового фуксина (окрашивание производилось через фильтровальную бумагу) и подогрели стекло над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1—2 минут, не доводя до кипения.
Слили краску со стекла, удалили фильтровальную бумагу и тщательно промыли препарат в водопроводной воде.
Обесцветили препарат 1% солянокислым спиртом (раствором соляной кислоты в 70° спирте) до тех пор, пока мазок не принял бледно-розовый тон (примерно 30—60 секунд).
Препарат промывали в воде 15-30 секунд.
Докрашивание препарата производили метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд. Затем мазки ополоснули 70° спиртом.
Сполоснули препарат в воде и высушили фильтровальной бумагой.
Препарат изучали под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры – синюю.
2.2.5. Окрашивание эндоспор по методу Битгера
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры B. subtillus в стационарной фазе роста
2. 10% формалин
3. Аммиачный метиленовый синий
4. 0,5% раствор сафранина
5. Вода
6. Спиртовка
Ход работы:
Нефиксированный мазок обработали 10 % формалином в течение 10 мин. 2. Мазок был промыт в проточной водой и высушен на воздухе.
Препарат был окрашен аммиачным метиленовым синим в течение 3 минут (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98 % раствора аммиака + 80 мл дистиллированной воды), при этом стекло нагревали над огнем до закипания красителя.
Промыли мазок проточной водой.
Докрашивание проводили 0,5 % раствором сафранина 3—5 минут, затем промыли водой, высушили на воздухе
Препарат изучали под микроскопом при масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Вегетативные клетки бактерий приобрели красную окраску, эндоспоры – синюю.
2.3.Окраска экзоспор по Шеффер-Фултону
Необходимое оборудование и реактивы:
1. Мазок культуры актиномицетов в стационарной фазе роста
1% водный раствор сафранина
5% раствор малахитового зелёного
Вода
Спиртовка
Ход работы:
Мазки культуры были зафиксированы над огнем.
Препарат окрашивали 5 % водным раствором малахитового зеленого в течение 5—10 мин.
Промывали препарат в проточной воде.
Докрашивание препарата проводили 1 % водным раствором сафранина в течение 30 с.
Промывали водой, и высушивали на воздухе
Препарат был изучен под микроскопом с использованием масляной иммерсии.
Результат окрашивания:
Экзоспоры окрасились в зелёный цвет, вегетативные клетки бактерий – в красный.
Выводы
Существует ряд методов, позволяющих подтвердить наличие спор в исследуемом материале путём окрашивания и последующей световой микроскопии.
Для окрашивания эндоспор применяются следующие методы: метод Вайсера – Хьюппе, метод Меллера, метод Шеффера – Фултона, метод Ожешки и метод Битгера.
Метод окраски по Шеффер-Фултону подходит как для выявления эндоспор, так и экзоспор.
Для визуализации спор могут быть использованы разные красители.
Основная проблема при окрашивании спор бактерий заключается в создании условий для связывания их со спорой, что обусловлено присущей ей высокой кислотоустойчивостью.
Процесс окрашивания спор бактерий является более сложным и многоэтапным процессом по сравнению с окраской вегетативных клеток.
Список литературы
Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. - 2001. - 736 с.
Верещагин Н.Н., Смирнова О.А., Плотникова О.А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. – 2007. – Т.3.– С. 93.
Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А.И., Рачковская И.В., Каплич В.М. М.: Колос. – 2001. – 538 с.
Ветеринарное законодательство. Т. 2, 3, 4. Под ред. А.Д. Третьякова. М.: Колос. – 1972
Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М.В., Минеева Л.А. – 3-е издание. –М: Академия. – 2007. – 464 с.
Кадымов Р.А., Мамедов И.Б., Джульфаев С.А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. – 1990. – 499 с.
Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. – М.: Колосс.- 2006. – 432 с.
Кузьмин В.А., Святковский А.В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. – 2005. – 429 с.
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. - 2004.- 691 с.
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. - М: Мир. - 1987. - 566 с.
Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. – М: Мир. - 1997 - в 2.т.
Справочник ветеринарного врача. Под ред. В.Г. Гавриша и И.И.Калюжного. – Ростов- на- Дону: Феникс. - 1999 – 608с.
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. - 2004.- с. 425
Гусев М.В., Микробиология: учебник/ Гусев М.В., Минеева Л.А. – 3-е издание. –М: Академия. – 2007. – с. 137
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. - М: Мир. - 1987. - с. 204
Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. - 2001. - с. 422
Кузьмин В.А., Святковский А.В., ред. Эпизоотология с микробиологией. М.: Академия. – 2005. – с. 232
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. - 2004.- с. 424
Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Академика РАМН А.А. Воробьева М.: Медицинское информационное агентство. - 2004.- с. 428
Общая микробиология: учебник / Шлегель Г; ред. Е.Н. Кондратьева, пер .с нем. Л.В. Алексеевой. - М: Мир. - 1987. - с. 312
Кадымов Р.А., Мамедов И.Б., Джульфаев С.А. Частная эпизоотология. Баку: Изд-во Бакин. гос. ун-та. – 1990. – с. 314
Определитель бактерий Берджи/ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Кинга, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса, пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина. – М: Мир. - 1997 - т.1. – с. 267
Ветеринарная и медицинская паразитология: Энциклопедический справочник. Ятусевич А.И., Рачковская И.В., Каплич В.М. М.: Колос. – 2001. – с. 346
Верещагин Н.Н., Смирнова О.А., Плотникова О.А., Коваленко Е.В.// Мат-лы IX съезда Всероссийского научно-практич. общества эпиде-миологов, микробиологов и паразитологов. Москва. – 2007. – Т.3.– с. 93.
Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М.: Медицинское информационное агентство. - 2001. - с. 437
Колычев Н.М., Ветеринарная микробиология и иммунология.: учебник для ВУЗов/ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. – М.: Колосс.- 2006. – с. 254
Ветеринарное законодательство. Под ред. А.Д. Третьякова. М.: Колос. – 1972. – т.2. – с. 412
32
13