"Б ог создал человека по Своему образу и подобию, следовательно, Человек д олжен жить вечно и бесконечно увеличивать свои знания ... клонирование — только один шаг" Ричард Сид Термин " клон " происходит от греческого слова " klon ", что означает - веточка, побег, черенок, и имеет отношение прежде всег о к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками, почкам и или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. При вегетативном размножении и при клонировании ген ы не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сох раняются в полном составе в течение многих поколений. Однако у животных есть препятствие. По мере роста их клеток, они в ходе клеточной специализации - дифференцировки - теряют способность реализовывать всю генетическую информац ию, заложенную в ядре Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Опыты с ними показали, что серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность. Уже в начале 90-х была решена и проблема клонирования эмбриональных клето к млекопитающих. Реконструированные яйцеклетки крупных домашних живот ных, коров или овец сначала культивируют не in vitro , a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - проме жуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантиру ют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответс твенно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Статья Уилмута с соавторами, появившаяся в начале 1997 года ст ала сенсационной именно потому, что впервые клональное животное (овца по кличке Долли) появилось в результате использования донорского ядра кле тки молочной железы взрослой овцы. У этого пе рвого успешного эксперимента есть существенный недостаток - очень низк ий коэффициент выхода живых особей (0,36%). Однако он доказывает возможность полноценного клонирования, (или получения копии взрослого человека). Ост аётся лишь разрешить технические и этические вопросы. Самое интересное, что методология клонирования, использованная Уилмут ом была подготовлена в СССР ещё в 1987-ом году, но в Академии наук на это проре агировали вяло - не до того, видимо… Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обо йти этические проблемы – вырашивать отдельные органы из клеток рецепи ента или использовать животных. Но это только "косметический" метод. Реал ьный шаг к бессмертию - искуственое изменение ДНК. В июне 2000 года и случилос ь то, чего так долго ждали и чего некоторые так боялись. Появилось сообщен ие, что ученым из уже знаменитой своей овцой Долли шотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Инс титута в Эдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек с измененной ДНК. Шотландские ученые смогли осуществить клонирование, при котором ге нетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону. Однако имен но этого, генетического вмешательства и боятся многие противники клони рования. Хотя Существует и уже узаконенный путь обхода запрета на клонирование человека, который называется "терапевтическое" клонирова ние человеческих существ. Речь идет о создании ранних эмбрионов - своего рода банка донорских тканей для конкретных индивидуумов. Именно исполь зуя, его американская компания Advanced Cell Technology Inc. (ACT, городе Вустер, штат Массачусет с) объявила в ноябре 2001 года об успешном клонировании человеческого эмбри она. Интересно отметить, что эта компания в октябре получила п равительственный грант 1.8 млн. $ на проведение исследований в области биот ехнологии. Порадовала и реакция конкурентов: "Я очень рада, что мы не одино ки. Мы получаем эмбрионы, каждый день", - заявила директор Clonaid Бриджит Босель е (Brigitte Boisselier). Для эксперимента учёные использовали в общей сложности 17 женских яйцекл еток: удалив из них ядра, они внедрили на их место ядра, позаимствованные и з клеток кожи взрослого человека. В трёх яйцеклетках начался нормальный процесс роста и деления. Когда эмбрионы состояли из 6-ти клеток каждый, учё ные прервали их дальнейшее развитие с тем, чтобы использовать полученны е клетки для дальнейших исследований. Следует отметить, что стволовые клетки, которые, собственно, и являются п редметом интереса ученых, занимающихся исследованиями в области терап евтического клонирования, можно выделить только из эмбриона, в своем раз витии достигшего стадии бластоцисты ( около сотни клеток). Однако специа листы ACT заявляют, что созданные ими, в другом эксперименте, обезьяньи зар одыши развились до стадии бластоцисты. Из эмбрионов были выделены ствол овые клетки, которые в ходе их специализации удалось превратить в нейрон ы. Сообщается, что эти нейроны оказались в состоянии вырабатывать допами н и серотонин - два важнейших гормона, которые вырабатываются мозгом. В интервью CNN президент компании ACT доктор Майкл Вест сказал, что его компан ия не заинтересована в клонировании людей, и что она не создавала эмбрио н человека для репродуктивных целей "Мы только хотим помочь больным людя м, нуждающимся в помощи, и в этом состоит работа всего нашего центра" Для этого используются стволовые клетки (упрощенно - клетки ранних чело веческих зародышей.). Потенциал роста стволовых клеток просто фантастич еский - достаточно вспомнить, что триллионноклеточный организм новорож денного человека образуется из одной-единственной клетки всего лишь за 9 месяцев! Но еще больше впечатляет потенциал дифференцировки - одна и та же стволовая клетка может трансформироваться в любую(!) клетку человека, будь то нейрон головного мозга, клетка печени или сердечный миоцит. "Взро слым" клеткам такая трансформация не по силам. Одно уникальное свойство этих клеток превращает их в поистине бесценный объект для медицины. "Чуж ие" стволовые клетки, введенные в организм человека, отторгаются гораздо слабее, чем пересаженные целые органы, состоящие из уже дифференцирован ных клеток. Это означает, что в принципе можно выращивать в лабораторных условиях предшественники самых разных клеток (сердечных, нервных, печен очных, иммунных и др.), и затем трансплантировать их тяжело больным людям в место донорских органов. Однако внезапно обнаружился вероятный предел клонирования - шесть поко лений. А в январе 2001 года появилась информация об открытии, которое может с делать клонирование просто не нужным. Удалось повернуть вспять биологи ческие часы внутри человеческой клетки, заставив ее вернуться к состоян ию, в котором она находилась на момент образования в эмбрионе. Но все ждут - когда-же появится первый клонированный человек. И если Ричар д Сид, объявивший об этой цели ещё в 1998-м году изчез в тени. Другой "старейший " игрок - секта "раэлитов" - по прежнему активна. Раэлиты убеждены в существо вании вестников из космоса, которые указали человечеству путь к процвет анию — экспоненциальный рост научной мощи и все более активное вмешате льство в природные процессы. Представители секты и не думают скрывать, ч то финансируют эксперименты по клонированию человека. В феврале 2002 го год а глава и основатель секты 55-летний канадец Клод Ворильон, бывший спортив ный репортер, ныне известный как Раэль, заявил, что исследования компани и «Клонэйд», приостановившей свою деятельность по клонированию челове ка из-за преследований правительства США, продолжаются в секретной лабо ратории: «Процесс протекает успешно, ребенок родится через 12 или 24 месяца ». После этого ещё несколько организаций заявило о том, что ждёт появлени я человеческого клона. И вот, наконец, в начале 2003-го года Раэ литы заявили о том что первый клонированный человек появился, но, к сожал ению, пока никаких интересных подробностей неизвестно КЛОНИРОВАНИЕ. История и Методология Первые опыты на амфибиях Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бригг с и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриона льных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энукле ированные) яйцеклетки. Они установили, что если брать ядра из клеток заро дыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев заро дыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального голо вастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующ ую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклет ки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в дру гих работах. Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в оп ытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в каче стве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специал изировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал уль трафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцек летки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбр ионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастик а и только 1% развился в половозрелых особей (рис. 1). Однако появление нескол ьких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длител ьное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли бы ть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых о пытов. Позже Гердон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконст руированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до з авершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии б ластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется "серийной пересадкой" в отличие от "первичной перес адки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось , и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, пол ученными в результате первичной пересадки ядер. Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в пи тательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и исполь зовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. Примерно 25% первично реконс труированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных п ересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким обра зом, было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного ( X. laevis ) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика. В сною очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации яд ра недслящихся и полносгью дифференцированных клеток крови - эритроцит ов лягушки Rana pipiens . После серийной пересадки так их ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего го ловастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше стадии голов астика не развивались. Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авто ры называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правиль нее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае м ы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей. Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается ина ктивацией неработающих генов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, д ифференцировка становится необратимой. В конце концов у одних клеток пр оисходит полное репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже ядро. Однако нар яду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат малодифференцированные ств оловые клетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для кло нирования млекопитающих. Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и тог о же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференци ровки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструи рованных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность. Неудачи экспериментов с мышами Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих р абот отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непо нятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объект ами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. О днако предсказание МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично. К тому врем ени, замечу, весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объек та. Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амф ибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы на учились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенн ых яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов . Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались ли шь до стадии бластоцисты. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопи тающих в период после проникновения сперматозоида, но до слияния мужско го и женского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужс кое ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из х ромосом яйцеклетки. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий развития, еще до его имплантации в матку. В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они п олучили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели голько магеринс кий, а две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от гого, какой пронуклеус б ыл оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи но типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторо в, с гем, что, удаляя один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого , обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные д иплоидные гомочиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в ма тку самки-реципиента для дальнейшего развития. Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомо зиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для полу чения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого ск ота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требую тся десятки лет работы. Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя м ногие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом дип лоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся и з неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы. Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в кл етку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что в ысокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер исп ользовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструиро ванные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцист ы . Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериме нтаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активирова нных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот, прон уклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенет ически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивали сь нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добав ить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйц еклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского я дра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации мужс кого и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мыш ей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона. Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуют ся два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из из вестных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоп пе и Илменси не удалось повторить. Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982 г оду они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы Некоторые из этих реконструированных яйцеклет ок нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результаты весьма маловероятны. Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зар одышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе ма теринского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функционал ьные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуетс я наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больш ий резонанс. Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бла стоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мыше й (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введ ение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один пр ием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В сле дующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клет ки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех по ловозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смо г добиться подобных результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение. МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутре нней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии мору лы, которая предшествует стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-кле точных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточны х зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты. Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточ ные ядра рано теряют тотипотентность, что связано очевидно, с очень ранн ей активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопит ающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация п ервой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной ста дии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрио нов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не ме нее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расшир или наши представления о методологии клонирования млекопитающих. Кролики, коровы и свиньи Американские исследонатели Стик и Робл, используя методик у МакГрата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой поро ды. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора. Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормал ьных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющ ий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичн ых животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возм ожность клонирования эмбрионов кроликов. Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro , a in vivo - в перевязанно м яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вым ывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - ко ровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения дет еныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в а гаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйце вод овцы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше раз виваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследо ватели получили неплохие результаты и при культивировании. Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения яд ра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солт ером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женск ий пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-кл еточных эбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освобо дить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хо рошо видны под микроскопом (рис. 2а), что значительно облегчало их удаление (рис. 2б). При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки и звлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей (рис. 2в) и переносили его в энуклеированную зиготу (рис. 2г). Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и перес ажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вы мывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зар одыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пере саживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или блас тоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коров ы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве донор ов использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы. Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластоме ров одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер с охраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструир ованных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После п ересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, о ни могут и дальше нормально развиваться. Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные заро дыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку си нхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из ни х были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в резул ьтате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона. Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достат очно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развит ие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудност и клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Н о остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотент ностью, для клонирования взрослых животных. Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа. Скудность данных, видимо.и связана с определенными трудностями работы с этим объектом. Клонирование овец Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные яйцеклет ки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались норм ально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цил индре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго ре ципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных зар одышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соотнетстиовал п ороде овец - доноров. В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбрио на и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки о вец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соо тветствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью с формировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответ ствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбри ональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммиро ваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие рекон струированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых облад ают тотипотентностью. Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута пол учила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культу ра эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образо м: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточна я культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбрио нальных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотне нными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-д невного зародыша овцы была обозначена как TNT4. Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных с тадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеиров анные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструирован ные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцев оды овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морул ы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципи ента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из ни х 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормал ьно развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягня та были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ. Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительн ое достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованна я в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорск ого ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только э мбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клет ки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, нахо дящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных кул ьтур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивиров ания, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочно й железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетк и) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов снача ла культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. К оэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при кул ьтивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки необходимости в про межуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro . Однако для полной уверенности в этом нужны дополни тельные данные.) Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной же лезы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональн ых клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку ок ончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже . В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцек леток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических мар керов всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибро бласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кли чке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра кот орой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсе т и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличаетс я от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат. Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длитель ных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток м огли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, в ероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также име л тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхр онизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток д оноров. Комментарий 2003-го года: В 2002 году у Долли было от мечено развитие артрита, который как предполагается, мог стать результа том генных мутаций, инициированных процессом клонирования. Помимо артр ита у животного наблюдался целый ряд отклонений от нормального развити я и в феврале ученые усыпили знаменитую овечку из-за прогрессирующей бол езни легких. Долли умерла в возрасте 6 лет. Ученые намерены детально проан ализировать состояние организма животного по результатам вскрытия Заключение Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начал е 50-х годов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех десятилетий. Ч то касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несм отря на значительные достижения, проблема клонирования взрослых особе й остается до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной диффе ренцировки у позвоночных происходит или потеря определенных генных ло кусов или их необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та час ть генома, которая контролирует не ранние, а более поздние этапы онтоген еза, в частности, метаморфоз амфибий. Механизм этого явления пока не подд ается научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослых по звоночных необходимо использовать малодифференцированные делящиеся клетки. Это методически важное положение было учтено в более поздних раб отах. В 1979 году американский биолог МакКиннел, внесший большой вклад в работу с амфибиями, утверждал, что полученные результаты не позволяют серьерно г оворить о возможности клонирования человека - тогда это казалось недост упным для экспериментальных эмбриологов. Однако еще в то время многие уч еные, писатели и даже политики стали активно обсуждать возможностт клон ирования человека, а некоторые исследователи даже приступили к таким эк спериментам. Например, Шеттлз сообщил, что пересадил ядро сперматогониа льной клетки (диплоидного предшественника зрелого гаплоидного спермия ) в лишенную ядра яйцеклетку человека. В результате три реконструированн ые яйцеклетки начали дробление, и возникли похожие на морулы скопления к леток, которые позднее деградировали. Шеттлз полагал, что если трансплан тировать такие группы клеток в матку женщины, то они могли бы нормально р азвиваться. МакКиннел тогда справедливо возразил, что такое предположе ние маловероятно и совершенно необоснованно. Еще 5-6 лет назад никто из ученых, а их работало довольно много в этой област и, не ставил вопрос об использовании в качестве доноров ядер клеток взро слых млекопитающих. Работы сводились, в основном, к клонированию эмбрион ов домашних животных, и многие из этих исследований были не очень успешн ы. Поэтому так поразило появившееся в начале 1997 года неожиданное для всех сообщение авторского коллектива под руководством Уилмута, что им удало сь, используя соматические клетки взрослых животных, получить клональн ое животное - овцу по кличке Долли. На самом деле, однако, исследователи пр ошли долгий путь, и Уилмуту с сотрудниками пришлось собрать воедино все существовавшие к тому времени достижения, прежде чем они смогли сообщит ь о сенсационном результате своей работы. У этого первого успешного эксперимента есть существенный недостаток - о чень низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%), и если учесть также высок ий процент гибели развивающихся реконструированных яйцеклеток в плодн ый период развития (62%), который в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%), т о встает вопрос о причинах гибели зародышей. Все ли пересаженные донорск ие ядра обладали тотипотентностью? Сохранялся ли полностью их функцион альный геном (набор генов, необходимых для развития), все ли нужные для раз вития гены были дерепрессированы? Это очень важные вопросы, и по одному ж ивотному нельзя сделать окончательные выводы. Тем более, что результаты исследований на амфибиях говорят о необратимом характере инактивации, репрессии генов в ходе клеточной дифференцировки. Возможно, авторам кру пно повезло, и они достаточно случайно в трех разных клеточных популяция х отобрали за короткий срок стволовые клетки, для которых характерна низ кая дифференцированность и способность к делению. Чтобы подтвердить ре зультат этой, в буквальном смысле слова с.енсационной работы, необходимы дополнительные исследования. В ближайшие годы главная задача исследователей, работающих в данной обл асти - это, по-видимому, создание культивируемых in vitro линий малодифференцированных стволовых клеток, характеризующ ихся высокой скоростью деления. Ядра именно таких клеток должны обеспеч ить полное и нормальное развитие реконструированных яйцеклеток, форми рование не только морфологических признаков, но и нормальных функциона льных характеристик клонированного организма. Исследования Уилмута и сотрудников имеют не только практическое, но и бо льшое научное значение для генетики развития. В сущности, они нашли усло вия, при которых цитоплазма ооцитов млекопитающих может репрограммиро вать ядро соматической клетки, возвращая ей тотипотентность. После публ икации этой работы сразу и широко стал дискутироваться вопрос о возможн ости клонирования человека. Чтобы его обсуждать, имеет смысл выделить дв а аспекта: методический и этический. Из изложенного выше следует, что методически или технически клонирован ие взрослых млекопитающих разработано еще недостаточно, чтобы можно бы ло уже сейчас ставить вопрос о клонировании человека. Для этого необходи мо расширить круг исследований, включив в него. кроме овец. представител ей и других видов животных. Уилмут с сотрудниками, например, планирует пр одолжить свои работы на коровах и свиньях. Такие работы необходимы, чтоб ы установить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослых м лекопитающих особенностями или спецификой какого-либо одного или неск ольких видов. Затем необходимо существенно повысить выход жизнеспособных реконстру ированных эмбрионов и взрослых клонированных животных, выяснить, не вли яют ли методические приемы на продолжительность жизни, функциональные характерстики и плодовитость животных. Для клонирования человека очен ь важно свести к минимуму риск, который, тем не менее, в определенной степе ни все равно останется, риск дефектного развития реконструированной яй цеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммиро вание генома донорского ядра. Что касается этической строны дела, клонирование человека вызывает еще больше возражений. Во-первых , становление че ловека как личности, базируется не только на биологической наследствен ности, оно определяется также семейной, социальной и культурной средой. При клонировании индивида невозможно воссоздать все те условия воспит ания и обучения, которые сформировали личность его прототипа (донора ядр а). Во-вторых , при бесполом размножении изнач ально жесткая запрограммированность генотипа предопределяет меньшее разнообразие взаимодействий развивающегося организма с изменяющимис я условиями среды (по сравнению с половым размножением, когда в формиров ании индивида участвуют два генома, сложным и непредсказуемым образом в заимодействующие между собой и с окружающей средой). В тре тьих , практически все религиозные учения настаивают, что п оявление человека на свет - в "руках" высших сил, что зачатие и рождение дол жно происходить естественным путем. Подводя итоги, следует признать, что говорить о клонировании человека мо жно лишь сугубо теоретически. В сущности речь идет даже не о клонировани и, а о получении копии отдельного индивида, поскольку термин "клонирован ие" предполагает получение некоего множества особей. Но слово уже прижил ось, поэтому имеет смысл пользоваться им по прежнему. Очевидно, что сегод ня вероятность отрицательных последствий этой процедуры значительно п еревешивает ее выгоды, поэтому, по моему глубокому убеждению, работы по к лонированию человека, как в настоящее время, так и в ближайшем будущем пр оводить нецелесообразно. Возможно, через какое-то время, когда будут усовершенствованы все этапы этого сложного биотехнологического метода, ученые, социологи и другие з аинтересованные лица смогут вернуться к обсуждению целесообразности к лонирования человека. Однако это время, думаю, наступит не скоро, и в любом случае решение вопроса о клонировании того или иного человека будет рег ламентироваться строгими рамками и правилами, касаясь, возможно, только некоторых медицинских проблем, скажем непреодолимого другими методами бесплодия. В то же время, работы с домашними животными очень важны с практической то чки зрения. Клонирование ценных трансгенных животных может быстро и эко номично обеспечить человечество новыми лекарственными препаратами, со держащимися в молоке, специально полученных для этого генноинженерным и методами овец, коз или коров. Клонирование высокопродуктивных домашни х животных, в частности, молочных коров, может произвести буквально рево люцию в сельском хозяйстве, так как только этим методом можно создать не отдельные экземпляры, а целые стада элитных коров рекордисток. Это же от носится к размножению выдающихся спортивных лошадей, ценных пушных зве рей, сохранению редких и исчезающих животных в природных популяциях и т. д. Новые технологии, без сомнения, приносят пользу человечеству, и их необх одимо всячески поощрять. Запреты нужны в тех крайних случаях, когда явно просматривается вред или ущерб для здоровья и благополучия людей. Пока к лонирование человека можно отнести к этому разряду. Нравственная сторо на проблемы, тем не менее, уже стоит в полный рост. Безудержно оптимистиче скую позицию, как мне представляется, занимают только люди, плохо знающи е вопрос. Тем, кто знает его, ясно: переносить еще не решенную методически научную разработку на человека безнравственно. Федерация научных обще ств экспериментальных биологов США - а это более 52 тыс. членов - в октябре 1997 года объявила пятилетний мораторий на эксперименты по клонированию че ловека. Ведь они подразумевают участие множества конкретных людей, кото рые захотят дать свои клетки, и суррогатных матерей, которые должны буду т выносить плод. А если так велико количество повреждений эмбрионов и ме ртворождений, если неясен вообще конечный результат, этично ли даже гово рить о переносе эксперимента на живых людей? Более того, найдутся безнра вственные люди, которые под маркой помощи бесплодным парам, к примеру, на чнут выманивать большие деньги, что скомпрометирует саму идею, научный п оиск. Я вовсе не отрицаю того, что в будущем, когда проблема будет полностью реш ена методически, человечество признает клонирование как метод помощи б есплодным парам, стремящимся иметь родного им ребенка. Хотя говорить, ск орее, надо будет не о ребенке как таковом, а об однояйцевом близнеце отца и ли матери, каким будет клонированный ребенок в биологическом смысле. Но тогда тем более потребуется заранее решить этические и юридические воп росы, как это было для трансплантации органов во многих странах мира. Нор мы биоэтики выдвигаются сейчас на первый план. Те нравственные заповеди , которыми человечество пользуется века, к сожалению, не предусматривают новых закономерностей и возможностей, какие вносит в жизнь наука. Поэто му людям и необходимо обсуждать и принимать новые законы общежития, учит ывающие новые реальности. КЛОНИРОВАНИЕ: ОЧЕЛОВЕ ЧИВАНИЕ. Вспомним, что наиболее близ ки к человеку по строению внутренних органов, как ни странно, свиньи. В марте 2000 г., биотехнологическая компания PPL Therapeutics объявила о том, что в их исследовательском центре родились пять клонированных поросят. Одна ко калифорнийская компания Geron Bio-Med прекратила финансирование дальнейших исследований, опасаясь непредвиденных последствий Клонирование свиньи более сложная операция, чем клонирование овец или к оров, так как для того, чтобы поддерживать одну беременность необходимо несколько здоровых плодов. Органы свиньи наиболее подходят к человеку п о размерам. Свиньи легко размножаются и известны своей неприхотливость ю. Но самой большой проблемой остается отторжение органа животного, кото рый человеческий организм не принимает за свой. Именно в этом направлени и будут развиваться дальнейшие исследования ученых из Розлин Институт а. Ученые видят один из возможных путей решения этой проблемы в том, чтобы генетически "замаскировать" органы животного, для того, чтобы человеческ ий организм не мог распознать их как чужие. Внимание ученых сосредоточен о на изучении гена под названием "alpha 1-3 gal transferase", который ответственен за отторж ение чужеродных тканей иммунной системой человека. Этот подход увенчался успехом 2 января 2002 года, когда всё та же PPL Therapeutics сообщила о появлении на свет пяти клонированных поросят (Рождество, Анге л, Звезда, Радость и Мэри), органы которых идеально подходят для пересадки человеку. В настоящее время учёные готовятся к пересадке свиных клеток о безьянам, а до людей очередь дойдёт только через четыре года Еще одной темой для исследования является попытка "очеловечить" генетич еским путем органы свиньи, для того чтобы значительно снизить риск оттор жения. Для этого предполагалось вводить человеческие гены в хромосомы к лонируемых свиней. Той же задачей, но без применения клонирования, занимаются и другие инст итуты. Например, компания "Imutran", расположенная в Кембридже, смогла получить целое стадо свиней, в генетическом наборе которых уже отсутствует одна и з ключевых характеристик, ответственная за отторжение чужеродных ткан ей. Как только будет получена пара мужской и женской особи, они будут гото вы производить на свет "генетически чистое потомство", с органами, которы е можно будет использовать для трансплантации. Новости из “ мира клонов “ Китайцы вырастили гибридный эмбрион кролика и челове ка Учёные использовали техн ологию клонирования, чтобы создать гибридные эмбрионы, содержащие соед инение ДНК человека и кролика. Само собой, эта дерзкая операция всполоши ла общественность. Возобновились дискуссии как об этичности самого кло нирования, так и о "скрещивании" человека с животными. Как сообщает Washington Post, группа учёных из Второго Шанхайского медуниверситет а ( Shanghai Second Medical University ) под руководством женщины — Хуэйчжень Шен (Huizhen Sheng) — сотворила более ста гибридных эмбрионов, соединив клетки челове ческой кожи с яйцеклетками кроликов. Гибридам в течение нескольких дней позволили развиваться в лабораторн ых блюдцах, а потом уничтожили, чтобы получить из них эмбриональные ство ловые клетки — законодательство Поднебесной не позволяет выращивать эмбрионов для опытов больше 14 дней. И вроде как всё у китайцев получилось, хотя аналогичные эксперименты аме риканских учёных, которые пытались создать гибридные эмбрионы, соединя я человеческие клетки с яйцеклетками коров, успешными не были. Сообщение китайских учёных, опубликованное в журнале Nature , подвигло ряд деятелей, в особенности религ иозных, раскритиковать их работу, назвав её неэтичной: А что если такой ги брид попадёт в матку и разовьётся? "Вырастет из сына свин"? Что это будет за существо? Кроликочеловек? Поборников этики не смутила ни благородная цель, которую поставили пере д собой создатели гибридов — обеспечить учёных и медиков столь необход имыми им стволовыми клетками, ни то, что человеческая ДНК в соединении яв ляла собой подавляющее большинство. Дело в том, что кролики пожертвовали для экспериментов ДНК митохондрии, хондриосомы, постоянно присутствующей в клетках. Дезоксирибонуклеинов ая кислота — неотъемлемый компонент митохондрии, способная к независи мому от ДНК ядра клетки процессу самовоспроизведения. Никому не известно, может ли гибридный эмбрион стать жизнеспособным зар одышем, хотя кое-какие эксперименты с другими животными показывают, что это крайне маловероятно. Тех же исследователей, кого эксперимент китайцев не возмутил, не поверг в шок, а заинтересовал, огорчило недостаточное количество деталей, содер жащихся как в публикации Nature, так и в материале журнала "Исследования клетк и" ( Cell Research ), издаваемого дважды в месяц Шанхайским институтом биологии кл етки Китайской академии наук ( Shanghai Institute of Cell Biology Chinese Academy of Sciences ). Ну, а сама группа Хуэйчжень Шен докладывает, что источником клеток кожи б ыли ткани крайней плоти двух 5-летних мальчиков и двух мужчин, а также ткан ь кожи лица 60-летней женщины. Они соединили эти клетки с яйцеклетками ново зеландского кролика, из которых большая часть ДНК была удалена. Получилось около 400 гибридных эмбрионов, из них чуть больше 100 дожили до ста дии, на которой начинают формироваться стволовые клетки. Таким образом, учёные с помощью ДНК животных рассчитывают начать "массов ое производство" человеческих эмбрионов, которые будут служить источни ком эмбриональных стволовых клеток. Эти клетки, как известно, могут прев ратиться во все виды тканей. Но чтобы создавать клонированные эмбрионы, учёным нужны здоровые и "спос обные" клетки-партнёры: типа клеток кожи человека, с одной стороны, и яйцек леток животных, которые могут "перепрограммироваться" на генетическом у ровне и стать "родными" клетками эмбриона — с другой. Поскольку получение человеческих яйцеклеток сопряжено с трудностями, риском и вообще — процесс этот дорогостоящий, учёные решили попытаться получить то же самое от животных. Главный вопрос здесь — совместима ли митохондрическая ДНК братьев наш их меньших с ядром ДНК клетки человека. Результаты китайского экспериме нта с кроликами являются ответом "Да". Хотя этот положительный ответ поро дил и протесты, и сомнения, группа Хуэйчжень Шен сумела и доказать кое-что . А именно: Стволовые клетки, полученные из гибридных эмбрионов, способны к росту в течение длительных периодов времени в лабораторных блюдцах и м огут превращаться в любой вид клетки. По мнению американских экспертов в области клонирования, работа китайс ких учёных — большой прогресс, поскольку в ней предлагается новая систе ма исследования механизмов взаимодействия яйцеклеток и взрослых клето к в эмбриональной стадии. В итоге эти исследования могут дать возможность глубже понять развитие человека, процессы заживления ран и регенерации тканей. Биолог из Гарварда ( Harvard University ) Дуглас Мелтон (Douglas Melton) отметил, что создание к итайцами "фантастического" эмбриона может кому-то напомнить химеру из гр еческой мифологии с головой льва, головой козла и хвостом змеи, но — это н е первый случай, когда учёные смешивают в лаборатории клетки человека и животных. Были, например, эксперименты с мышами, которых для исследований "обеспеч ивали" клетками человеческого мозга или частями иммунной системы. Работу китайцев Мелтон назвал "чрезвычайно интересной" и выразил надежд у, что они не свернут с выбранного пути. В то же время, Ричард Дёрфлингер (Richard Doerflinger) из Американской конференции като лических епископов ( U . S . Conferense of Catholic Bishops ) заявил, что ги бридные эмбрионы в достаточной степени человечны, чтобы заслужить защи ту: "Мы рассматриваем этот организм, как человеческую разновидность". Кст ати, а что думают по этому поводу сами кролики? Доклад по биологии на тему: Клонирование Выполнил: Ученик 11 “ А ” класса МШК №1 г. Горки Панченко Михаил Горки 2003.