Настоящее и будущее биосенсоров

Содерж ание Введение 3 Что такое биосенсор 3 Как работает биосенсор 5 Где применяют биосенсоры 6 Биосенсоры на основе других биоматериалов 7 Проблемы и перспективы развития 9 Литература 11 Вв едение Биологические методы позволяют судить о присутствии ка кого-либо вещества или его количественном сод ержани и по характеру и величине его воздействия на определенный организм , взятый как индикаторный . Аналитическим сигналом при этом является изменение состояния жизнедеятель ности этого организма , то есть его реакция на раздражитель , которым , например , могут быть токсиканты среды обитания или какие-либо другие биологически активные соедине ния , вызывающие нарушение жизненных функций и ндикаторного организма или его гибель . К б иологическим методам относят и биохимические методы , в частности ферментативные , а также ра з личные методики , например индика торные трубки на основе ферментов и други х биологических материалов . Интересно , что мех анизм получения информации о составе какого-л ибо объекта с помощью этих методов и устройств моделирует процесс в живой природе , что особ е нно важно при анали зе объектов биологического происхождения. Известно , что ферменты - это биологические катализаторы , обладающие ярко выраженной спо собностью избирательно катализировать многие хим ические превращения как в живой клетке , та к и вне организма. Замечательные свойств а ферментов давно привлекали внимание исследо вателей , в том числе и аналитиков , но п рактическому применению ферментов , например для аналитических целей , препятствовали прежде всег о малая доступность чистых ферментов , неустой чивость в о времени их растворов , при хранении и воздействии на них различных факторов (тепловых , химических ), невозможность многократного использования одной порции фермента из-за сложности отделения его от других компонентов раствора , высокая с тоимость о чищенных препаратов . Однако выход из положения вскоре был найден , и появилась возможность использования каталитичес ких свойств ферментов вне их связи с живым организмом и возможность сохранения это й способности в течение длительного времени практически бе з изменения . Достижен ия в этой области биохимии и энзимологии дали начало развитию нового направления аналитической химии - безреагентных методов анализ а , основанных на использовании различных биох имических сенсоров. Что та кое биосенсор Под терми ном "биосенсор " следует понимать устройство , в котором чувствительный слой , содержащий биол огический материал : ферменты , ткани , бактерии , д рожжи , антигены / антитела , липосомы , органеллы , рецепторы , ДНК , непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента , генериру ет сигнал , функционально связанный с концентр ацией этого компонента . Конструктивно биосенсор представляет собой комбинированное устройство , состоящее из двух преобразователе й , или трансдьюсеров , - биохимического и физического , находящихся в тесном контакте друг с другом . Биохимический преобразователь , или биот рансдьюсер , выполняет функцию биологического элем ента распознавания , преобразуя определяемый компо нент , а точнее , инфо р мацию о хи мических связях в физическое или химическое свойство или сигнал , а физический преобра зователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры . В данном случае реа лизуется принципиально новый способ получения информации о химическом соста в е раствора . Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высок ой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси , не прибегая ни к каким дополнительным операциям , связ анным с использованием других реагентов, концентрированием и т . д . (отсюда и назва ние - безреагентные методы анализа ). Существует большое разнообразие физических трансдьюсеров : электрохимические , спектроскопические , термические , пьезоэлектрические , трансдьюсеры на поверхностных акустических волн ах и т.п . В настоящее время наибольшее распространени е получили электрохимические преобразователи . Одн и из них генерируют потенциал на специаль ном электроде , на поверхность которого нанесе н слой биоматериала , другие генерируют электр ический ток реакции пр о дукта прев ращения определяемого вещества на поверхности электрода , вызванного биоматериалом . Другими сл овами , существуют потенцио - и амперометрические биосенсоры . Если физический преобразователь исп ользует изменение светопоглощения в области б иослоя , то т а кой биосенсор называе тся , например , оптоволоконным , поскольку измеряемый сигнал будет передаваться измерительному при бору по оптическому волокну . Соответствующий физический преобразователь по аналогии с элек тродом называют оптродом . По названию преобра зов а теля можно сделать вывод о характере физического свойства , которое измеряе тся аппаратно , причем , как правило , при так ом измерении используется микропроцессорная техн ика , позволяющая сделать устройство достаточно компактным. Первое упоминание об аналитическ их устройствах на основе ферментов или фермен тсодержащих материалов появилось сравнительно не давно , в 60-х годах нашего столетия . Затем в обиход вошло понятие "биосенсор " или "б иочип ". Это важное событие в науке . Здесь отражаются глубокие причины , связанн ы е с так называемыми интеграционно-синтети ческими процессами в науке , приводящими к появлению новых знаний . Функционально , таким о бразом , биосенсоры сопоставлены с датчиками ж ивого организма - биорецепторами , способными преобр азовывать все типы сигналов , п о сту пающих из окружающей среды , в электрические. Как работает биосенсор Принцип р аботы биосенсора достаточно прост . Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую ме мбрану в тон кий слой биокатализатора , в котором и протекает ферментативная реакция . Поскольку в данном случае продукт фермен тативной реакции определяется с помощью элект рода , на поверхности которого закреплен ферме нт , то такое устройство еще называют ферме нтным элект р одом . Таким образом , о пределения "биосенсор " и "ферментный электрод " в данном случае синонимы. Следует отметить , что характер ферментати вной реакции зависит от природы фермента , типа его каталитического действия . Среди ферм ентов можно выделить оксидоредукт азы , осу ществляющие реакции окисления и восстановления , гидролазы , катализирующие гидролиз , трансферазы , вызывающие перенос ацильных , гликозидных и т.п . остатков и т.д . Многие ферменты сейчас доступны , их чистые препараты включены в каталоги ряда фирм-про и зводителей . Важно отметить , что при конструировании био сенсора увеличение продолжительности действия фе рмента становится основной задачей . Дело в том , что нативный фермент сохраняет свои свойства лишь в течение относительно корот кого времени . Поэтому была разработана операция так называемой иммобилизации фермен та . В ходе иммобилизации с помощью специал ьных реагентов фермент "закрепляют " либо на поверхности адсорбентов , например силикагеля , у гля или целлюлозы , либо вводят в пленку пористого полимера , либо к о валентно , то есть с помощью химических связей , "пришивают " к какой-либо подложке . При этом фермент закрепляется , перестает быть подвижным , не вымывается из биослоя , а его каталит ическое действие сохраняется .. Как видно , при иммобилизации ферментов использ у ют разнообразные способы их закрепления , в том числе и комбинированные . Биосенсоры могут быть сконструированы и по так называемой объемной технологии , при которой индивидуальные компоненты , составляют как бы единый физи ческий ансамбль . Хотя такие биосенсо р ы в настоящее время и применяются на практике , они имеют недостатки , есть трудности и при их изготовлении . В самом деле , послойное покрытие электрода или ка кого-либо твердого преобразователя мембраной долж но быть воспроизводимо . Соответствующая технологи я формирования поверхности должна доп ускать возможность изготовления достаточно миниа тюрного электрода . Кроме того , биосенсоры со сравнительно толстыми мембранами дают в ит оге большее время отклика , имеются сложности и при их градуировке . Успехи в област и р а звития средств микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосенсор ов к новым решениям . Оказалось перспективным использовать так называемую планарную технол огию (фотолитографию , полупроводниковую технику по крытий и т . д .), по которой можно изг о товить так называемый биочип , объ единяющий сенсорную систему , трансдьюсер , аналого-ц ифровой преобразователь и микропроцессор для измерения аналитического сигнала и расчета ре зультатов анализа . Хотя такие биочипы могут тиражироваться , основной проблемой в д анном случае будет являться воспроизводим ость состояния , то есть микроструктуры поверх ности с нанесенным слоем биологически активно го фермента . Трудной задачей представляется в данном случае и оптимизация такой структ уры в отличие от объемной технологии , р еализованной присутствием в конструк ции сенсорной части нескольких молекулярных с лоев . Тем не менее "молекулярный дизайн " пр и конструировании биосенсоров будущего может составить реальную конкуренцию объемному их в арианту. Где применяют биосенсоры По-видимому , самым распространенным в настоящее время я вляется амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для определения сахара в крови . Исторически этот биосенсор явля ется самым "древним ". В настоящее время для определения глюкозы создано на ибольшее число различных биосенсоров , что свя зано с необходимостью контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях , например в крови , при диагностировании и лечении некотор ы х заболеваний , прежде всего диабета . Схема функционирования биосенсора н а глюкозу в принципе типична и для др угих амперометрических биосенсоров с аналогичным трансдьюсером . Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямо пропорционален кон центраци и кислорода . В присутствии с убстрата (например , глюкозы в крови , взятой для анализа ) ферментативная реакция понижает концентрацию O 2 .Таким образом , ток восстановления кислоро да уменьшается пропорционально концентрации субс трата Преимущество данного типа био сенсора состоит прежде всего в его высокой с елективности . Избирательность подобных биосенсоров определяется высокой специфичностью глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции , в к оторой участвуют компоненты ферментативного проц есса . В целом класс ф ерментов - ок сидаз является высокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам . Системы же на основе небиологического преобразователя , напротив , не столь селективны , как этого бы хот елось , что обусловлено рядом причин . Тем н е менее имеются ограничен и я и по применению данной конструкции биосенсора , обусловленные влиянием кислорода и других посторонних веществ , способных проникать через биослой (точнее , через мембрану ), а потому задача совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозу представляется весьма актуальной. Один из возможных путей такого усовер шенствования заключается в следующем . Если из менить полярность включения электрода-трансдьюсера в глюкозном биосенсоре на противоположную , то есть платиновый катод сделать анодом , т о при потенциале + 0,6В он становится совершенно нечувствительным к кислороду , но зато дает отклик на пероксид водорода , который при данном значении потенциала окисля ется до воды . Чувствительность такого электро да к пероксиду водорода оказалась привлекател ьной , а поскольку в ода образуется как продукт ферментативной реакции , по его содержанию можно сделать вывод о концент рации , например глюкозы в различных объектах . Другой способ улучшения селективности биосе нсоров и устранения помех от посторонних примесей состоит в использо в ании различных мембран - пленок , предотвращающих их попадание непосредственно на электрод-преобразователь . При этом внутренняя мембрана выполняет ф ункцию защиты от примесей , а внешняя мембр ана пропускает субстрат в биослой . Однако необходимо отметить , что с помощью специальных приемов , называемых химической модифи кацией , можно до такой степени изменить св ойства поверхности электрода , что он будет "глухим " к большинству примесей и , напротив , чувствительным к компонентам ферментативной реакции. Биосенсоры , ос нованные на кислородном электроде как физическом трансдьюсере , позво ляют определять разнообразные субстраты ферменто в : кроме глюкозы - лактаты , L-аминокислоты , салици латы , оксалаты , пируваты , то есть анионы со ответствующих карбоновых кислот . В литературе о писаны другие биосенсоры подобного типа , ряд которых применяется на практике . С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу : при некоторой определенной концентрации субстрата оценивать активность собственно фермента по величине измеряемого с игнала ( потенциала , тока и т . д .). Из описания работы фермента следует , что изм еряемый сигнал зависит не только от конце нтрации субстрата , но и от каталитической активности биологического преобразователя , то ест ь фермента . Такое использование биосенсоров п озв о ляет измерить активность большого числа ферментов , например в крови . Оценка активности ферментов , связанных с сердечной деятельностью , таких , как аспартамаминотрансфераз а , креатинкиназа , позволяет в клинических усло виях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы использу ются в педиатрии. Биосенсоры на основе других биоматериалов Многие фе рменты дороги и быстро теряют свою активн ость , использование выполненных на их ос нове биосенсоров не может быть экономически целесообразным . Поэтому применение бактерий , микроорганизмов и биологических тканей различног о происхождения более предпочтительно , поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном пол у чении и очис тке ферментов . К существенным недостаткам так их биосенсоров можно отнести низкую селективн ость определения вследствие того , что клетки живых организмов фактически являются источни ком самых разнообразных ферментов . Помимо это го время отклика би о сенсоров на основе тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим , что также уменьшает и х практическую ценность . Тем не менее в последнее время наблюдается повышенный интерес к разработке конструкций электродов , содержа щих не сами ферменты в очище н ном виде , а их первозданные источники - био логические материалы . Так , было установлено , чт о тканевые срезы в биосенсорах могут выпо лнять функцию источников каталитической активнос ти . Например , создан биосенсор на аскорбиновую кислоту , состоящий из платино в ого электрода и пластины кожуры огурца или тыквы , служащей источником аскорбиноксидазы . Ак тивность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определений аско рбиновой кислоты в различных объектах . Устано влено , что пластины биоматер и ала м огут храниться без потери активности в те чение года в 50%-ном глицерине. Аналогичный подход использовали при созда нии конструкции биосенсора на допамин - важней ший биогенный амин , участвующий в регуляции деятельности мозга . В данном биосенсоре тка нь п лода банана была иммобилизована н а поверхности кислородного электрода . В рассм отренных случаях биоматериалы создают "естественн ое окружение " для ферментов , способствующее ст абилизации их активности . Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую сп е цифичность , что очень важно для биосен сора , тогда как выделенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются . Известны биосенсоры , в которых использован цельный фра гмент ткани печени быка , являющийся носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кис л ородном электроде . Ферментативное действие каталазы , проявляющееся в катализе р еакции разложения пероксида водорода , используют в этом случае для создания соответствующ его электрода . Разработан биосенсор на основе кожуры кабачка или огурца и кислородного э лектрода для определения L-аскорбин овой кислоты во фруктовых соках , функционирую щий подобно аналогичному типу электрода , уже рассмотренного выше . Тем не менее , несмот ря на успехи в развитии биосенсоров на основе биологических материалов , надежность их фун к ционирования все еще остаетс я спорной . Еще один пример конструкции био сенсорного устройства относится к ферментному электроду на основе микроорганизмов - дрожжей , помещаемых между двумя пористыми мембранами . Биосенсор на основе иммобилизованных дрожжей и к ислородного электрода позволяет определять этанол и метанол , например в промышленных стоках. Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов , служащих элементом так называемого микробного сенсора . В качестве примера т аких устройств можно упомянуть амперометрический се нсор на аммиак (в сточных водах ) на осн ове иммобилизованных нитрифицирующих бактерий и кислородного электрода . Такой биосенсор поле зен при решении вопросов охраны окружающей среды , и в частности при контр о ле степени очистки промышленных стоков. Можно отметить также использование биосен соров на основе гидролаз - ферментов , являющихс я катализаторами гидролитического расщепления су бстратов . Эти биосенсоры предназначаются , как правило , для эколого-аналитическог о контроля остаточных количеств пестицидов класса фосфоро рганических соединений , а также для определен ия некоторых ОВ . Если при гидролизе какого -либо субстрата ферментом класса гидролаз обр азуется электрохимически активное соединение , то , контролируя соде р жание последнего , можно контролировать ферментативную реакцию та к же , как в предыдущих случаях . Однако в присутствии веществ , являющихся ингибиторами , активность фермента уменьшается , что и обна руживается по сигналу , регистрируемому электродом . Интересно о тметить высокую чувстви тельность такого определения : эффект изменения активности фермента доступен для измерения уже при действии ультраследовых количеств ингибитора - на уровне пико - и фемтограмм Проблемы и перспективы ра звития Концепция распознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказалась плодот ворной . В итоге исследователи приобрели новое средство , позволяющее быстро получить достов ерную информацию о со стоянии окружающей среды и здоровья человека . Некоторые биос енсоры уже получают распространение для индив идуального использования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в кров и ). Интерес к биосенсорам непрерывно растет . В 1996 году состоял и сь четыре круп ные международные конференции по биосенсорам. Если иметь в виду все разнообразие ферментов , присутствующих и действующих в ж ивом организме и являющихся потенциальными би ологическими преобразователями , то следует отмети ть , что существующее сег одня число кон струкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз . Биосенсоры получают распространение в биотехнологии . Хотя здесь и встречаются трудности , связанные с невысокой термической устойчивостью предложенны х устройств , приводящей к дезактивации биослоя , есть основания полагать , что дан ный недостаток будет в скором времени пре одолен . Так , полагают , что для увеличения с рока службы биосенсоров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты , выделе нные из термофильных бактер и й и одноклеточных водорослей - микроорганизмов , устойчив ых к действию высоких температур . Определенны е трудности представляют собой также проблемы градуировки биосенсоров и надежности их показаний . Для улучшения последнего показателя , в частности , предлаг а ется использов ать мультисенсорную систему , состоящую из ряд а биочипов . Для получения определенной "емкост и " надежных данных производится расчет необхо димого числа таких датчиков . Однако в цело м так называемые метрологические характеристики биосенсоров впо л не приемлемы . Отн осительное стандартное отклонение определяемой к онцентрации не выше 10-12 %, притом что нижняя г раница определяемых содержаний достигает 10-15 моль /л . Некоторые биосенсоры работают по принцип у да-нет , что вполне приемлемо , когда решае тся в опрос о присутствии ультрамалы х количеств высокотоксичных веществ в объекта х окружающей среды . Если определяемые компоне нты находятся в сложной смеси или матрице или же близки по своим свойствам , то при анализе используют хроматографические ме тоды разделе н ия . Контроль за разде лением осуществляют с помощью системы детекто ров на основе биосенсоров . И здесь получен ы поразительные результаты : разделяют и колич ественно определяют оптические активные изомеры , различные сахара (лактозу , фруктозу , глюкозу и т.д .), сложные по структуре биологически активные соединения и т.п. Вот один из недавних примеров разрабо тки биосенсоров , основанных на использовании природного хеморецептора . Хеморецептор , извлеченный из чувствительных антенн (органелл ) голубого морского краба , был прикреплен к ульт рамикроэлектроду , измеряющему потенциал . В результ ате был изготовлен новый тип потенциометричес кого детектора , чрезвычайно быстро реагирующего на ничтожные изменения состава среды , в которую он погружен . Сам голубой краб о чень чувстви т елен к следам тяжелы х металлов и живет только в чистейшей морской воде. На очереди создание биосенсоров , заменяющ их рецепторы живых организмов , что позволит создать "искусственные органы " обоняния и вк уса , а также применить указанные разработки для возможн о более точной и информ ативной диагностики ряда заболеваний . Несомненно , что в ближайшем будущем в этой смежн ой области биологии и химии следует ожида ть новых открытий. Литература 1. Био с енсоры : основы и приложения / Под ред . Э . Тернера и др . М .: Мир , 1992. 614 с. 2. Будников Г.К ., Майстренко В.Н ., Муринов Ю.И . Вольтамперомет рия с модифицированными и ультрамикроэлектродами . М .: Наука , 1994. 239 с. 3. Будников Г.К ., Медянцева Э.П ., Баб кина С.С . // Успехи химии . 1991. Т . 60. С . 881.