Применение биотхнологии в пищевой промышленности

Человек стал пользоваться микробиологическими процессами на ранних этапах цивилизации, применяя их как средство сохра нения и консервирования продуктов питания. Примерно за 100 лет до н. э. технология пивоварения приобрела те черты, которые имеет сегодня. Аналогична история возникновения виноделия, хлебопечения и сыроварения. Древние жители Европы и Азии освоили мастерство сыроварения за несколько столетий до нашей эры. Народы Древнего Востока использовали м икроорганизмы, подвергая крахмалсодержащие продукты воздействию микроскопи ческих грибов. К той же эпохе относится получение кисломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков и др. Древние народы использовали способы приготовления хлеба, пива, вина и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй ства) стал причиной революции в изготовлении продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад и привела к изобретению техники земледелия — началу производительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века). В это время формируются цивилизации Месопо тамии, Египта, Индии и Китая. Первые жители Месо потамии (территория современного Ирака) шумеры создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. Б этом следовали им ассирийцы и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издрев ле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах — индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам Пастера. В те древние времена продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии (8— -7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая более 30 000 клинописных табличек, из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом городе размещался сад лекарственных растений. К тому же древнему периоду относятся: получение кис ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков. Длительное накопление фактов происходило и в области ми кологии (от греч. Мукоз — гриб). Сведения о грибах можно найти в источниках древности, а Луций Лициний Лукулл (106 — 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами("лу куллов пир"), предпочитал всем съедобным грибам кесарев гриб ( Amanita cesarea , L . J . Древние народы хорошо знали ржавчину хлебных злаков и головню. В IV — I веках до н. э. были собраны интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах Аристотеля, Диоскорида, Плиния Младшего, Теофраста. Перспективы использования продукции биотехнологии в пищевой промышленности (по Н. С. Егорову, А. В. Олескину, В. Д. Самуилову, 1987) Цистеин, метионин, лизин Глутамат Глицин, аспартат Аспартам, тауматин, мо неллин а-Амилаза Глюкоамилаза Инвертаза Пуллуланаза Аминокислоты Повышение питательной ценности белков, в том чис ле белка одноклеточных Усиление аромата мясных, рыбных и других изделий Придание кондитерским изделиям и напиткам кис ло-сладкого вкуса Олигопептиды Выработка низкокалорийных, суперсладких веществ Ферменты Производство спирта, вин, пива, хлеба, кондитерских изделий и детского питания Получение глюкозы, удаление декстринов из пива Выработка кондитерских изделий Производство мальтазных (в сочетании с р-амила- зой) или глюконовых (в сочетании с глюкоамчлазой) фруктозных сиропов из крахмала -Галактозидаза Цел л юл азы Пектиназа Микробная протеаза Пепсин, папаин Фицин, трипсин, браме- лаин Липазы Глюкозооксидаза, каталаза А, В, В 2 , В 6 , В 12 , С, D , Е, РР С, Е Терпены Гераниол, нерол Уксусная, бензойная, мо лочная, глюконовая, ли монная, яблочная Освобождение молочной сыворотки от лактозы, приготовление мороженого и др. Приготовление растворимого кофе, морковного дже ма, улучшение консистенции грибов и овощей, об работка плодов цитрусов Осветление вин и фруктовых соков, обработка цитру совых плодов Сыроварение, ускорение созревания теста, производ ство крекеров, улучшение качества мяса Осветление пива Ускорение процесса маринования рыбы, отделение мяса от костей Придание специфического аромата сыру, шоколаду, молочным продуктам, улучшению качества взбитых яичных белков Удаление кислорода из сухого молока, кофе, пива, майонезов, фруктовых соков для их улучшения и удлинения сроков хранения Витамины Повышение питательной ценности продуктов Антиоксиданты и родственные соединения Ароматизаторы Органические кислоты Консерванты, ароматизаторы Ксантаны Полисахариды Загустители и стабилизаторы кремов, джемов ИСТОЧНИКИ ПИЩЕВОГО БЕЛКА Грибы Как известно, взрослому человеку при умеренной физической нагрузке ежедневно необходимо с пищей получать около 12,5 кДж (3 тыс. кал). Эту потребность в энергии могут покрыть 75 г сахара. Но пища обеспечивает нас не только калориями. Орга низму нужен материал для роста и регенерации устаревших клеток и тканей, поэтому пища должна содержать белки, жиры, углеводы и витамины. По самым скромным подсчетам в масштаб ах планеты дефицит пищевого белка оценивается в 15 млн т в год. Такими источниками пищевого белка могут быть биомасса грибов. Съедобные грибы являются строго сапрофитными организма ми. В ходе эволюции грибы сформировали сложные симбиотиче- ские взаимоотношения с другими обитателями почвы — микро организмами и растениями. Это учли биотехнологи, когда в середине 50-х годов начали эксперименты по выращиванию мицелия высших грибов в биореакторе подобно тому, как уда лось в индустриальных условиях выращивать мицелий микро мицетов. Экспериментаторов увлекло предположение, что вегетативное тело высших грибов (мицелий, грибница) по своим вкусовым и питательным свойствам будет аналогично плодовым телам гриба. В значительной степени это предположение оправдалось, однако выращивание мицелия высших грибов оказалось весьма трудным делом: необходима питательная среда сложного соста ва, включающая пектины, пептиды, аминокислоты (аргинин, глутаминовую кислоту, аспарагин, метионин и др.), витамины (биотин, фолиевая кислота, рибофлавин и пр.), сахара, комплекс минеральных элементов. Кроме того, чтобы мицелий имел пище вую ценность и свойства грибного деликатеса, он должен иметь вкус и аромат грибов. Установлено, что аромат и вкус грибов каждого вида обус ловлен особым комплексом ароматических веществ, которые грибы в естественных условиях получают либо в чистом виде, либо в виде предшественников из окружающей среды (гумуса почвы), или при помощи симбионтов. Ароматизация мицелия и придание ему высоких вкусовых свойств оказались самой слож ной задачей. Пока точно не установлены все вещества, опреде ляющие органолептические свойства грибов, поэтому ароматиза цию мицелия грибов осуществляют эмпирически, путем добав ления в питательный субстрат экстрактов корней деревьев, молока, ферментолизатов дрожжей, отвара тыквы, экстрактов пшеничных ростков, сафлорового масла, высших спиртов и дру гих природных субстратов и химикатов. Питательную ценность имеет только мицелий истинных съедобных грибов — макромицетов (белый гриб, лисички и др.), в составе которых отсутствуют токсичные вещества. Мицелий условно съедобных грибов (сморчки, строчки, рыжики и др.), плодовые тела которых перед употреблением следует тщательно варить, для пищевых или кормовых целей непригоден. Несмотря на существенные трудности, эксперименты по выра щиванию макромицетов в биореакторе продолжаются. Болгар ский микробиолог А. Торев вырастил мицелий трутовика ( Polypo rus squamosus ) на мелассной среде и за 24— 26 ч культивирова ния получил в пересчете на СВ 18— 20 г мицелия на 1 л среды. Многие исследователи считают, что в будущем выращивание мицелия макромицетов обеспечит решение проблемы белка в масштабах всей планеты. Промышленное культивирование мицелия высших грибов пока находится на стадии экспериментов, а мицелий микромице тов уже давно используется в питании человека. В пище жителей Азии и Дальнего Востока доминирует крахмал и не хватает белков. Для обогащения крахмалсодержащих продуктов белками и придания им вкуса мяса в этих странах уже с древних времен на растительных продуктах выращивают специально подобран ные и естественным путем селекционированные виды плесневых грибов. Характерным элементом восточной кухни является про дукт под общим названием «темпе». В Индонезии арахисовые или соевые лепешки употребляют в пищу обросшими плесневыми грибами рода Rhisopus . Арахисовое темпе содержит до 40 % белковых веществ и по вкусу напоминает мясные изделия. Япон ская кухня славится продуктом под названием «нате». Его получают из обросших плесневым грибом Aspergillus oryzae соевых бобов. Продукт имеет характерный острый вкус. В Китае аналогичным способом изготовляют сырообразный деликатес «суфу» (красный творог), используя для этого соевые бобы и некоторые виды плесневых грибов рода Mucor . Незаменимую приправу восточной кухни — соевый соус готовят с использова нием особых штаммов плесневого гриба Aspergillus oryzae , бактерий Pediococcus soyae , дрожжей Saccharomyces rouxii и некоторых видов дрожжей рода Torulopsis . Сказанное не охватывает все области использования плесне вых грибов в древней и современной кулинарии, но характеризу ет принципиальные возможности использования микромицетов в качестве источника пищевого белка как в промышленных, так и в домашних условиях. Съедобные водоросли Народы Тихоокеанского побережья с давних пор употребляют в пищу морские и океанские водоросли. Жители Гавайских островов из 115 видов водорослей, обитающих в местных океан ских пространствах, используют в питании 60 видов. В Китае также высоко ценят съедобные водоросли. Особенно ценятся сине-зеленые водоросли Nostoc pruniforme , по внешнему виду напоминающие сливу и по вкусовым качествам причисленные к китайским лакомствам. В кулинарных справочниках Японии встречается более 300 рецептур, в состав которых входят водо росли. На Дальнем Востоке весьма интенсивно используют водо росли в пищевых целях и плантации не успевают восстанавли ваться естественным путем. В связи с этим все чаще водоросли культивируют искусственно, в подводных садах. Выращивание аквакультур — процветающая отрасль биотехнологии. Водоросли используют также в виде сырья для промышленности. В последнее время внимание специалистов, занимающихся вопросами питания, привлекает сине-зеленая водоросль спирули на ( Spirulina platensis и Spirulina maxima ), растущая в Африке (оз. Чад и в Мексике (оз. Тескоко). Для местных жителей спирулина является одним из основных продуктов питания, так как содержит много белка, витамины А, С, D и особенно много витаминов группы В. Биомасса спирулины приравнивается к лучшим стандартам пищевого белка, установленным ФАО. Спи- рулину можно успешно культивировать в открытых прудах или в замкнутых системах из полиэтиленовых труб и получать высо кие урожаи (примерно 20 г биомассы в пересчете на СВ с 1 м 3 в сут). Дрожжи Дрожжи — постоянный спутник человека, они используются в разных микробиологических процессах. Однако биомассу дрож жей как источник пищевого белка человек применяет только в экстремальных условиях (во время голода) или в качестве компонента сухого пайка (например, для альпинистов, морепла вателей). Одна из причин малой популярности дрожжевых блюд является сравнительно толстая клеточная оболочка дрожжей, препятствующая усвоению его организмом. Наши представления о питательной ценности дрожжей посте пенно меняются. Человек хорошо овладел искусством выращива ния дрожжей в промышленных условиях, биотехнологи освоили технологию выращивания богатой белками биомассы хлебопекар ных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на простых синтетических средах (например, на этиловом спирте микробного или химиче ского происхождения), а химики разработали способы выделения из дрожжевой биомассы очищенных белковых концентратов. Хлебопекарные дрожжи могут метаболизировать этиловый спирт благодаря наличию в клетках алкогольдегидрогеназы, но рост дрожжей на этаноле имеет множество особенностей. Стимули рующее действие на этанольные дрожжи в синтетической среде оказывают минимальные добавки аминокислот: глутаминовой (0,07%), аспарагиновой, а также глутатиона (рис. 1). Глута- миновая кислота повышает активность мальтатдегидросеназы (на 140%) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (на 90%), в то же время снижая активность ЫАДР-зависимой глутаматде- гидрогеназы. Это позволяет предположить, что экзогенная глута-миновая кислота не включается в ЦТК, но оказывает оберегающее действие на метаболиты этого цикла, поскольку расходуется на анаболические цели. При выращивании хлебопекарных дрожжей на синтетической этанольной среде в лабораторном ферментаторе при непрерывном режиме с добавкой 0,5 % дрожжевого экстракта достигнута концентрация биомассы в пересчете на СВ 8— 9 г/л при выходе 70— 75% от использованного субстрата. Вместо дрожжевого экстракта можно применять кукурузный экстракт или депротеи низированный сок картофеля. В некоторых странах Западной Европы развито производство из этанольных дрожжей очищенных белковых концентратов, которые предпола гается добавлять в колбасный фарш. В Англии освоено произ водство пищевого дрожжевого продукта на глюкозе. У нас и за рубежом ведутся исследования по получению дрожжевых белковых изолятов пищевого назначения. Использование макромицетов, микромицетов и водорослей в питании человека имеет более древние традиции, чем использование картофеля, капусты и других продуктов зем леделия. Тот факт, что люди в основном ориентировались на потребление продуктов земледелия, скотоводства и рыболовства, возможно, объясняется тем, что в этих областях пищевого производства в свое время удалось достичь высокой производи тельности труда. Потенциальные возможности биотехнологии обеспечивают повышенную продуктивность микроорганизмов, сравнимую с продуктивностью земледелия и даже превосхо дящую ее. Витамины. Витамины поставляются в орга низм с пищей или их назначают в форме лекарственных препара тов при определенных патологических процессах. Из жиро- и водорастворимых витаминов известны биотех нологические процессы производства витаминов а и D , рибофла вина, аскорбиновой кислоты, цианкобаламина (В 12 ). Каротаноиды — это изопреноидные соединения, синтезирую щиеся многими пигментными микроорганизмами из рода Aleuria , Blakeslea , Corynebacterium , Flexibacter , Fusarium , Halobacterium , Phycomyces , Pseudomonas , Rhodotorula , Sarcina , Sporobolomyces и др. Всего описано около 500 каротиноидов. Из одной молекулы -каротина при гидролизе образуются две молекулы витамина ai . Это имеет место, например, в кишечнике человека. ""* сн , сн 3 i . 1 н=сн— с=сн— сн=сн— с=сн— сн 2 он СН 3 Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в свободном состоянии — в липидных гранулах в цитоплазме. Каротиноид "ретиналь" у галофильного вида — Halobacterium halobium — соединен с белком через остаток лизина(опсинопо-добный белок); он участвует в синтезе АТФ благодаря генерации транс мембранного потенциала. В целом, основная функция каро тиноидов — защитная. Их биосинтезу в клетках способствует свет. В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta . Спариваю щиеся ( + ) и (— ) штаммы этих видов при совместном культивирова нии могут образовать 3— 4 г каротина на 1 л среды. Питательные среды для производства витаминов сложные и включают источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специаль ных стимуляторов (гидрол, кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, -ионон или изопреновые димеры). Вначале штаммы выращивают раздельно, а затем — совместно при 26°С и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Длительность ферментации — 6— 7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном (или другим полярным раство рителем), переводят в неполярный растворитель. В случаях извле чения белково-каротиноидных комплексов, применяют повер хностно-активные вещества в концентрации 1— 2%. В целях очи стки и более тонкого разделения можно прибегать к методам хроматографии или к смене растворителей. Витамин A из (3-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе. В случае изготовления каротинсодержащей биомассы для скар мливания животным и птицам возможно ее сочетанное примене ние с витамином А или без него. В медицинских целях витамин А изготавливают в капсулах для приема через рот. Витамин D — это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Поэтому, например, пекарские или пивные дрожжи применяют для получения зргостерина, как провитамина, обладающего антирахитическим действием. Содержание эргосте рина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2— 11%. При недостатке в организме гормона 1,25-дигидроксихолекаль циферола, предшественником которого является витамин D 2 у детей развивается рахит (аналог рахита у взрослых — остеомаля ция). Трансформация эргостерина в витамин D 2 (кальциферол) про исходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке (позиции 22, 23). Эта последняя гидриро вана в витамине D 3 (холекальциферол). Физиологическая актив ность обоих витаминов ( D 2 и D 3 ) равноценна. Кроме дрожжей продуцентами эрогостерина могут быть мице лиальные грибы — аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2— 2,2% эргостерина. Замечено, что полиеновые антибиотики, действующие на клеточную мембрану дрожжей, заметно стимули руют их содержание в биомассе. Получение эргостерина в производственных условиях можно подразделить на следующие этапы: размножения исходной культуры и накопление инокулюма, ферментация, сепарирование кле ток, облучение клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание и упаковка целевого продукта. Так, применительно к дрожжам, инокулюм получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток, после чего основ ную среду с ацетатом (активатором биосинтеза стеринов), обога щенную источником углерода и содержащую пониженное коли чество азота (высокое значение C / N ), засевают сравнительно большим объемом инокулята. Культивирование дрожжей (фермен тацию) проводят при температуре, близкой к максимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации (2% О 2 в газовой фазе). Спустя 3— 4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами — УФЛ (длина волны 280— 300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени, при требу емой температуре и с учетом примесных веществ. Эти контроли руемые показатели, установленные опытным путем, указываются в регламентной документации. Облучение дрожжей можно прово дить до сепарирования клеток в тонком слое 5% суспензии, учи тывая малую проникающую способность УФЛ. Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в промышленности их выпускают под названием "кормовые гидро лизные дрожжи, обогащенные витамином D 2 ". В таком препарате содержится не менее 46% сырого белка, незаменимые аминокис лоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D 2 /г. В случае получения кристаллического витамина D 2 клетки продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110°С, затем температуру снижают до 75— 78°С и добавляют этанол. Смесь фильт руют при 10— 15°С, оставшуюся после фильтрации массу промы вают водой, высушивают, измельчают, нагревают до 78°С и дважды обрабатывают тройным объемом этанола. Спиртовые экстракты объединяют и упаривают до 70%-го содержания сухих веществ. Полученный "липидный концентрат" обрабатывают раствором ед кого натра. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фрак ции концентрата при 0°С. Его очищают повторной перекристаллизацией. Кристаллы высушивают, растворяют в серном эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D 2 кон центрируют и кристаллизуют. "Кислотный фильтрат" обычно упаривают до 50%-го содержа ния сухих веществ и применяют как концентрат витаминов. Производят также масляный концентрат витамина D 2 . Рибофлавин, или витамин В 2 — содержится в клетках различ ных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопро-теинов (прежде всего — соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз — ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штам мы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Ashbyii gossypii , Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii . Учитывая изменчи вость активных продуцентов названных видов по способности синтезировать витамин В 2 , необходим систематический отбор культур в процессе их эксплуатации на производ стве. Обычно активные продуценты первых двух видов формируют яркооранжевые колонии на агаризованных средах. Методами ген ной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образу ющий около 6 г рибофлавина в 1 л среды, включающей мелассу, белково-витаминный концентрат и его гидролизат. Высокий выход рибофлавина у Е. ashbyii коррелирует с азотом пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых должно быть достаточным. В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрож жевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира). Жидкие питательные среды для получения инокулюма и для основной ферментации могут несколько различаться между собой. Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигид рофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращива ния продуцента на этой среде — 2 суток при 27— 30°С (в зависи мости от штамма). Ферментационная среда обычно включает ку курузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщен ный жир. Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5— 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В 2 , вначале — в мицелии, а затем — в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточ ной влажностью 8%, содержащий 1,5— 2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных. В случае высоких выходных показателей по рибофлавину, витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине. Для Candida guillierniondii важно регулировать содержание железа в питательной среде; оптимальные концентрации колеб лются, в среднем, от 0,005 до 0,05 мкг/мл. При этом определенные штаммы дрожжей могут образовывать за 5— 7 дней до 0,5 г/л и более витамина. Однако для целей промышленного производства рибофлавина предпочитают использовать более продуктивные ви ды и штаммы грибов — E . ashbyii и Ashbyii gossypii . Аскорбиновая кислота, или витамин С — это противоцингот ный витамин, имеющийся у всех высших растений и животных; толькг человек и микробы не синтезируют ее, но людям она неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И, тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты — L -сорбозы. Таким обра зом, весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным. СН 2 ОН процесс • »• НОН Ј СО(СНОНиСН,ОН у (трансформация) L -сорбозз L -асИОрбиновая Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвя занной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диаде- тоном и получение диацетон — L -сорбозы, окисление диацетон — - L -сорбозы до диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты, подвергаемой затем гидролизу с получением 2-кето-1,-гулоновой кислоты; послед нюю подвергают энолизации с последующей трас формацией в L -аскорбиновую кислоту. Ферментацию G . oxydans проводят на средах, содержащих сорбит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной аэрации (8— 10 г О 2 /л/ч). Выход L -сорбозы может достичь 98% за одни-двое суток. При достижении культурой log -фазы можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25%. Также установлено, что G . oxydans может окислять и более высокие концентрации полиспирта (30— 50%), создаваемые на последних стадиях процесса. Это происходит благодаря полиолде- гидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме. Принципиально доказана возможность получения L -сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ. Цианкобаламин, или витамин В 12 — получают только микроби ологическим синтезом. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium shermanii M -82 и Pseudomonas denitrificans M -2436 продуцируют на жидкой среде до 58— 59 мг/л цианкобаламина. Учитывая важную функцию витамина в организме человека (он является противоанемическим фактором), его мировое произ водство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуют на медицинские нужды, а 3,5 т — в животноводстве. Отечественное производство цианкобаламина базируется на использовании культуры P . freudenreichii var . shermanii , культиви руемой в периодическом режиме без доступа кислорода. Фермен тационная среда обычно содержит глюкозу, кукурузный экстракт, соли аммония и кобальта, рН около 7,0 поддерживают добавлением NH 4 OH ; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол — предшественник ви тамина Б 12 и продолжают ферментацию еще 3 суток. Цианкобала мин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5— 5,0 и температуре 85— 90°С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добав ляют коагулянты белка — хлорид железа трехвалентного и алю миния сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упари вают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3— 4°С из в одноацетонового раствора. Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукты, которые сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты. При реализации данного биотехнологического процесса не забывать о высокой светочувствительности витамина В 12 , поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете). На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат КМБ 12 — концентрат, содержащий витамин В 12 и другие ростовые вещества. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В МОЛОЧНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Молочнокислые продукты У каждого народа имеется хотя бы одно национальное блюдо, приготовленное путем брожения. В Армении широко потребляют мацони, в Болгарии популярен кефир, во Франции — сыры типа Рокфор, русская кухня немыслима без ржаного хлеба и просток ваши. Из национальных блюд эти продукты превратились в общепризнанные, интернациональные. Еще И. И. Мечников в конце прошлого века обратил внима ние на важность нормальной деятельности кишечной микрофло ры и в случае нарушения — необходимость ее восстановления с помощью молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus , предотвращающих развитие чужеродных микробов. Чистые куль туры этих бактерий используют для получения ацидофилина. Его изготовляют из стерильного молока стерилизация 15 мин при 120 °С или 30 мин при 110°С), добавляя чистую посевную культуру и выдерживая 20— 48 ч при температуре 35— 37 °С до получения продукта требуемой кислотности. Количество живых бактерий L . acidophilus в ацидофилине должно быть не менее 200 млн в 1 мл, содержание молочной кислоты в хорошо приго товленном ацидофилине 0,65— 0,75 %. Во время брожения ацидо фильные бактерии синтезируют органические кислоты (в основ ном молочную), ассимилируя глюкозу, галактозу, лактозу и другие сахара. Популярным отечественным молочнокислым продуктом можно считать ке фир. В глубокой древности для приготовления кефира кобылье, козье, овечье или коровье молоко засевали так называемыми «кефирными зернами». Это была естественная симбиотическая микрофлора, включающая молочнокислые бактерии Lactobacil lus casei , дрожжи Saccharomyces kefir и некоторые виды сопут ствующих стрептококков. Молоко сбраживалось в бурдюках; в результате выделения диоксида углерода напиток становился шипучим. Современный кефир в основном готовят путем заква шивания коровьего молока. Микрофлора другого молочнокислого продукта — йогурта — смешанная, но доминирует болгарская палочка Lactobacillus bulgaricus , сбраживающая глюкозу, галактозу и лактозу. Кумыс получают из кобыльего молока с помощью молочно кислых бактерий ( Lactobacillus casei и др.), стрептококков и дрожжей, сбраживающих лактозу. L Приготовление сыра Сыр готовят из творога, полученного в результате сверты вания казеина цельного или обезжиренного молока. Свертывание казеина происходит под влиянием микробных ферментов и мо лочной кислоты или при помощи сычужного фермента. В сверты вании принимают участие молочнокислые бактерии Streptococcus lactis , S . cremoris , S . diacetilactis , Leuconostoc citrovorus . В ре зультате свертывания белка кальций отделяется от казеина, последний выпадает в виде хлопьев водонерастворимой казеино вой кислоты. Для изготовления различных видов сыра исполь зуют овечье, козье, коровье или кобылье молоко. В зависимости от технологии сыроварения сыворотку полностью или частично отделяют от творога на фильтр-прессе. Творог засевают культу рами микроорганизмов в соответствии с сортом получаемого сыра. При его созревании под влиянием выделяемых микро организмами ферментов химический состав и физические свойства творога существенно меняются. Острый привкус сыра Рокфор обусловлен действием микробной липазы — фермента, расщеп ляющего жиры молока с образованием жирных кислот (капроно вой, каприловой, каприновой и др.). Созревание сыра длится от нескольких недель до нескольких месяцев (для сыра Чеддер — 8 мес . В первые недели созревания число микроорганизмов в массе сыра увеличивается и дости гает нескольких сотен миллионов на 1 г массы сыра, потом число живых бактерий и дрожжей снижается. Сыр должен созревать при пониженной температуре (для сыра Рокфор - не выше 9°С). В производстве молочнокислых продуктов важным компонентом является закваска — чистая посевная культура. Цеховые и заводские микробиологические лаборатории, а также отраслевые научно-исследовательские институты непрерывно следят за чистотой и качеством заквасок. Использование ферментов в молочной промышленности В молочной промышленности широко используют ферменты в целях повышения качества продукции и расширения ассорти мента. Для коагуляции белков при изготовлении сыра применяют сычужный фермент реннин (гимозин), получаемый из желудка (сычуга) молодых телят. В настоящее время более 500 сортов сыра изготовляют с применением реннина (гимозиновые сорта). Он является эффективным сгустителем казеина и расщепляет минимальное количество молочных белков до водорастворимых компонентов. Чтобы удовлетворить спрос на реннин, разработано несколько способов получения аналогичного фермента микробного проис хождения. Еще в 20-е годы было предложено использовать в сыроварении протеазы плесневого гриба рода Mucor , однако предложенные грибы оказались непригодными, главным образом из-за синтеза неприемлемых побочных продуктов. В 60-е годы было выделено два термофильных штамма мукоральных грибов Mucor pusilus и М. miehei , синтезирующих подходящие ферменты, хотя оказалось, что микробный реннин имеет более высокую по сравнению с животным протеолитическую активность. Хорошими сгустителями являются также протеазы других микроорганизмов ( Pseudomonas mixoides , Bacillus licheniformis , Edothea parasitica и др.). В настоящее время в сыроварении используют около 10% реннина микробного происхождения. Имеются сведения об успешной трансплантации в клетки бактерий гена, отвечающего за синтез реннина в организме животных, что существенно увеличивает возможности использования микробного реннина. В молочной промышленности применяют каталазу, использо вание которой совместно с пероксидом водорода позволяет исключить процесс пастеризации, проводимой с целью инактива ции патогенной и посторонней микрофлоры. В результате пасте ризации частично теряются естественные ферменты молока. Пероксид водорода в концентрации 0,2— 0,3 % от объема молока выполняет функции дезинфектора, существенно не влияя на ферменты молока (липазу, протеазу, фосфатазу). Добавки ката- лазы инактивируют остатки пероксида водорода в молоке. Молочный сахар При производстве I т сыра образуется 9 т сыворотки и пахты. В каждой тонне сыворотки содержится около 5 кг высоко качественного белка, витамины группы В, комплекс свободных аминокислот, все важнейшие минеральные элементы, в том числе фосфор и кальций. Но главной ценностью сыворотки является лактоза. В 1 т сыворотки содержится около 50 кг молочного сахара — ценнейшего сырья для пищевой и микробиологической промышленности. Лактоза имеет низкую сладость, но при дей ствии на нее лактазы расщепляется на два моносахарида - глюкозу и галактозу. У нас и за рубежом разработано несколько биотехнологических приемов для рационального использования сыворотки и пахты. На вторичном молочном сырье можно выращивать культуры кормовых дрож жей, обладающих лактазной активностью (Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis, Candida pseudotropicalis и др .). Из этих дрожжей можно выделить лактазу. Весьма перспективным является выделение из депротеинизи рованной сыворотки Сахаров путем биогидролиза молочного сахара с помощью иммобилизованной лэктазы. Степень конвер сии молочного сахара составляет 80%. Продукты гидролиза (глюкоза и галактоза) успешно применяют в разных отраслях пищевой промышленности, например для приготовления мороже ного. Добавление этих Сахаров в мороженое препятствует кри сталлизации Сахаров, и его можно сохранять длительное время (до 4 мес). САХАРОЗА И ЕЕ ЗАМЕНИТЕЛИ Инверт Как известно, чрезмерное потребление углеводов отрицательно влияет на здоровье. Существует два пути уменьшения излиш ней калорийности пищи без снижения традиционной потребности человека в сладостях. Первый путь — употребление вместо сахарозы более сладких Сахаров, например фруктозы. Второй путь — использование искусственных подсластителей типа са харина. Сладкий фруктозный сироп можно изготавливать из сахарозы путем кислотного гидролиза (например, лимонной кислотой) или более эффективным фермен тативным способом — инверсией — с помощью дрожжевой ин вертазы. Инверт содержит, как известно, два моносахарида -глюкозу и фруктозу. Для более эффективной инверсии сахарозы дрожжевые клетки лучше подвергнуть плазмолизу, а освободившуюся ин вертазу адсорбировать на костяном угле. Эту технологию исполь зует фирма Tate and Lyle (Великобритания). В настоящее время фирма усовершенствовала технологию: используется иммобилизованный чистый фермент, инверсия осуществляется при температуре 70 °С и получается 70— 75%-ный раствор инверта. Разработан метод инверсии сахарозы при помощи иммоби лизованных дрожжей, обладающих инвертазной активностью. В качестве носителя клеток используется термоустойчивый гелеобразный субстрат, сохраняющий твердую консистенцию при температуре 75 °С. Концентрация сахарозы в исходном субстрате 70%, концентрация биокатализатора 100 г/л, темпе ратура инверсии 75 °С, ее продолжительность 3 ч. У нас в стране инверсии сахарозы уделяется большое внима ние, так как ограниченные ресурсы крахмала и его дефицит не позволяют в обозримом будущем рассчитывать на широкомасш табное производство фруктозных сиропов. Отечественными биотехнологами разработана технология инверсии сахарозы с помощью иммобилизованных в геле клеток Sac . serevisiae . В экспериментальных условиях получен инверт, который можно использовать в пищевой промышленности. Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН предложен метод получения экстрацеллюлярной инвертазы путем частичной дезин теграции клеток дрожжей во время культивирования. В Институ те микробиологии имени А. Кирхенштейна разработана методика получения экстрацеллюлярной инвертазы при культивировании дрожжей рода Kluyveromyces . Подсластители Радикального уменьшения потребления сахарозы в пище можно достичь, если использовать подсластители типа сахарина. Биотехнологи предлагают использовать ряд весьма эффективных продуктов. Так, из цветочного растения Thaumatococcus damelii , произрастающего в Судане, в кишечную палочку Escherichia coli был трансплантирован ген, детерминирующий синтез сверх сладкого белка тауматина. Рекомбинантная бактерия стала продуцентом сладкого белка, который производят на нескольких биотехнологических заводах и применяют в пищевой промышлен ности в качестве искусственного подсластителя. Из южноамери канского растения Stevia rebaudiana в клетку Е. coli трансплан тирован ген сладкого белка стевозида. С помощью генной инженерии или путем совмещения микробного синтеза с химиче ской трансформацией микробных метаболитов получен ряд следующих исключительно эффективных подсластителей. Сладость по сравнению Сладость по сравнению с сахарозой с сахарозой Сахарин 300,0 Цикламат 50,0 Глицерин 100,0 Ацесульфат К 150,0 Сорбит 0,5 Аспартам 200,0 Ксилит 1,0 Стевозид 150,0 Маннит 0,7 Тауматин 3 000,0 Особый интерес представляет сладкий дипептид аспартам, молекулу которого образуют две аминокислоты — фенилаланин и аспарагиновая кислота. Обе аминокислоты можно синтезиро вать микробиологическим путем, а аспартам из этих мономе ров — с помощью ферментов. Повышение спроса на аспартам стимулирует производство фенил ал анина и аспарагиновой кислоты. На основе фруктозы создается новый класс подсластителей — заменителей сахарозы. Установлено, что фруктозилолигосахари ды, состоящие из 2 до 5 фруктозил-остатков, связаны по 1-му и 2-му атомам углерода. Эти фруктозилолигосахариды не разру шаются в организме человека, имеют сладкий вкус и безвредны. Продуцируют их микроорганизмы, содержащие фруктозилтранс- феразу (представители родов Aspergillus , Fusarium , Aureobasi - dium ). Создана биотехнологическая система на основе иммоби лизованных в геле альгината кальция (2 %-ного) клеток Aureobasidium pullulans ( Jong Won Gun et . al ., 1989 . Клетки про дуцента работали стабильно в течение 60 сут при температуре 50 °С, рН 5,5 и скорости протока 0,05 ч~ -1 . Содержание сахарозы в среде составляло 77 %, выход фруктозилолигосахаридов - 55 %. Хорошие результаты можно получать при полунепрерывном процессе конверсии сахарозы с заменой субстрата через каж дые 20 ч. ПИЩЕВЫЕ КИСЛОТЫ Пищевыми принято называть четыре органические кислоты: лимонную, молочную, уксусную и винную; иногда к ним причис ляют яблочную и глутаминовую. Уксусная кислота Уксус в виде прокисшего вина был известен за 7 тыс. лет до н.э., но только в 1868 г. Луи Пастер установил физиологи ческую природу уксуснокислого брожения, вызываемого уксусно кислыми бактериями Acetobacter oxidans , A . aceti , A . xylinum и др. Чтобы уксуснокислое брожение протекало нормально, сахар, содержащийся в сбраживаемом субстрате, должен быть превращен в этиловый спирт, поэтому уксуснокислому брожению предшествует спиртовое. В производстве уксуса спиртовое бро жение лучше всего осуществляют селекционированные штаммы винных дрожжей (например, Saccharomyces ellipsoideus ), кото рые помимо этанола синтезируют побочные продукты метаболиз ма, улучшающие вкус и аромат уксуса. Уксус, полученный микробиологическим путем (пищевая уксусная кислота, столовый уксус), как и вино, различается по сортам в зависимости от характера сбраживаемого субстрата. Известен яблочный, виног радный, грушевый и другие сорта уксуса. Уксус, полученный при брожении, имеет приятные аромат и вкус, которые обуслов ливают побочные продукты брожения: сложные эфиры (этилаце тат и др.), высшие спирты, органические кислоты. Уксусная кислота стала первым микробиологическим продук том, полученным с помощью иммобилизованных клеток. В течение длительного времени применяется адсорбирование уксуснокислых бактерий на древесной стружке, древесном угле, коксе и других субстратах. Пропуская раствор этанола через генераторы с иммобилизованными бактериями, получают 10— 15 %-ный раст вор уксусной кислоты. Из 100 л безводного этанола теоретически должно быть получено 103 л уксусной кислоты. На практике выход уксуса из 100 л этанола редко превышает 90 л, что связано с переокислением и неполным окислением этанола уксуснокислыми бактериями, а также с его испарением. Ежегодно в мире производят более 100 тыс. т уксусной кислоты (около половины получают химическим путем в виде техни ческой уксусной кислоты). Уксус широко применяют в пищевой промышленности. Техническую уксусную кислоту используют для производства ацетона, ацетилена, синтетических красителей, медицинских препаратов (аспирин, антипирин, фенацетин), ароматизирующих веществ (кумарин, ванилин), а также как субстрат для микробиологической биотрансформации. Установлено, что продуцент уксусной кислоты из рода Aceto bacter , развиваясь на поверхности среды, образует слизистую пленку, которая состоит из целлюлозы (90%) и клеток бактерий ( J . D . Fontana , 1989). Если эту пленку снять, высушить и соответ ственно обработать, можно получить достаточно прочные био фильмы медицинского назначения. Если ожоговые раны покрыть такими биофильмами, они заживают в течение 7— 8 сут. Ферментацию сахарозных сред реализуют в две стадии. На первой стадии при помощи дрожжевой инвертазы получают инвертный сахар, на второй с помощью Acetobacter xylinum - уксусную кислоту. Вторая стадия длится 60 ч, за это время углеводы (их содержится 6%) сбраживаются, рН снижается до 2, и на поверхности жидкой фазы формируется целевой, продукт — биофильм. Лимонная кислота В природе это вещество встречается довольно часто, глав ным образом в незрелых плодах цитрусовых, ананасов, груш, инжира, брусники, клюквы и др. Лимоны и апельсины были главными источниками естественной (растительной) лимонной кислоты, которую производили преимущественно в Италии, где в середине XIX в. начали действовать первые заводы по произ водству кристаллической лимонной кислоты. Затем аналогичные заводы начали действовать в Калифорнии (США), на Гавай ских островах и в Вест-Индии. Для получения лимонной кислоты путем микробного синтеза в лабораторных условиях использовали микромицеты ( Aspergillus clavatus , Penicillium luteum , P . citricum , Mucor piriformis , Usti na vulgaris и др.), но для промышленного биосинтеза наиболее подходящим оказался Aspergillus niger . Впоследствии из него было селекционировано множество производственных штаммов для биосинтеза лимонной кислоты из сахарозы. Многие органические вещества сбраживаются микромице тами и могут быть трансформированы в лимонную кислоту, но максимальный выход получается при биосинтезе из сахарозы или фруктозы. В последнее время успешно завершены эксперименты по биосинтезу лимонной кислоты дрожжами ( Candida lipolytica и др.) из парафинов и низших спиртов (этанола) с высоким выхо дом (80— 140%). Лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза. Ее общий выпуск в различных странах достигает 400 тыс. т в год (по данным В. А. Смирнова, 1983). Лимонную кислоту получают в основ ном из мелассы. Заводы небольшой или средней мощности производят лимонную кислоту поверхностным методом культи вирования. Глубинный метод экономически выгоден тогда, когда мощность завода превышает 2500 т лимонной кислоты в год. Лимонную кислоту широко используют в кулинарии и в пи щевой промышленности для приготовления безалкогольных на питков, мармелада, вафель, пастилы и др. Лимонная кислота включена в рецептуры некоторых сортов колбас и сыра, ее при меняют в виноделии, для рафинирования растительных масел, для производства сгущенного молока. С помощью лимонной кислоты сохраняются естественные вкус и аромат при длитель ном хранении в замороженном состоянии мяса и рыбы. При умеренном употреблении лимонная кислота стимулирует деятельность поджелудочной железы, возбуждает аппетит, способствует усвоению пищи. Натриевые соли лимонной кислоты стимулируют вспенивание и механическую устойчивость пен, поэтому лимонную кислоту ценят кулинары, ее также применяют для изготовления шампу ней и моющих средств. Последнее имеет важное экологическое значение, так как лимонная кислота и ее соли легко поддаются микробиологической деградации при очистке канализационных вод. Молочная кислота Эта кислота всегда присутствует в кислом молоке и в виде побочного продукта при получении уксусной и лимонной кислот. Молочнокислые бактерии трансформируют в молочную кис лоту самые разные углеводы, поэтому для промышленного по лучения этой кислоты используют глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, осахаренный крахмал и пр. После выбора субстрата подыскивают подходящий продуцент. Для сбраживания глюкозы или мальтозы обычно применяют штаммы Lactobacillus delb - rueckii , L . leichmannii или L . bulgaricus . Для сбраживания oca харенного крахмала используют смесь молочнокислых бактерий L , delbrueckii или с L . bulgaricus , или со Streptococcus lactis . При сбраживании мальтозы выход молочной кислоты выше при использовании L . bulgaricus или L . casei . В России производство молочной кислоты из крахмала было организовано в 1923 г. под руководством В. Н. Шапошникова на основе селекционированных штаммов L . delbrueckii . Сейчас молочную кислоту получают из мелассы в количестве примерно 100 т в год. Молочную кислоту используют в пищевой промышленности (для приготовления кондитерских изделий, безалкогольных на питков), в производстве витаминов, в медицинской промыш ленности, в производстве пластмасс и в других отраслях народ ного хозяйства. Винная кислота Винная кислота в свободном виде или в виде солей часто встречается в природе. Она входит в состав многих плодов и ово щей, выделяется в виде кальциевых солей при изготовлении вин. Винную кислоту можно получать путем микробного синте за. Для этого разработаны эффективные технологические прие мы, однако до сих пор винную кислоту выгодно получать хими ческим путем из винного камня. Винную кислоту применяют в пищевой промышленности, медицине, кожевенной и текстильной промышленности. Первые заводы по производству винной кислоты химичес ким путем в нашей стране были построены в Одессе и Риге и начали давать продукцию еще в 1890 г. Все большее значение в народном хозяйстве и в медицине приобретает яблочная кислота. Она содержится во фруктах. Яблочную кислоту применяют в органическом синтезе (напри мер, в синтезе урацила). Ее получают путем химического син теза из малеиновой кислоты, но возрастающий спрос на яб лочную кислоту стимулировал разработку способов ее микро биологического синтеза. В 1929 г. японский микробиолог С. Киносита выделил из соленых слив новый вид микромицетов Aspergillus itaconicus , который синтезировал сравнительно редко встречаемую органи ческую кислоту— итаконовую. С 1944 г. с помощью итаконовой кислоты стали производить синтетические волокна, была разра ботана технология микробного синтеза итаконовой кислоты с использованием Aspergillus terreus . В России итаконовую кислоту производят с 1962 г. Техноло гия ее биосинтеза разработана на Экспериментальном заводе биохимических препаратов Института микробиологии АН ЛатвССР. ДРОЖЖИ И ПРОДУКТЫ ДРОЖЖЕВОГО БРОЖЕНИЯ Дрожжи являются одними из самых распространенных микроорганизмов. Они встречаются в верхних слоях почвы, в пыли, ягодах и цветах, во многих растениях. Они почти всегда встречаются на яблоках, грушах, винограде, смородине, клуб нике и других плодах. Иногда дрожжей так много, что они об разуют налет сероватого цвета, видимый невооруженным гла зом. Дрожжей много в почве садов и виноградников. Дрожжи распространяют пчелы, осы и другие насекомые, а также ветер. Попадая в благоприятную среду, дрожжи размножаются с уди вительной быстротой. В течение всей истории цивилизации дрожжи постоянно находились в сфере деятельности человека и часто напоминали о себе, вызывая процессы брожения раз личных продуктов. Хлебопекарные дрожжи Этот вид дрожжей — Saccharomyces cerevisiae — известен человеку уже 4 тыс. лет. Самые давние сведения об использова нии дрожжей для приготовления хлеба найдены в Египте. В Рос сии хлебопекарные дрожжи выращивали в монастырях начи ная с 14— 15 в. Прессованные хлебопекарные дрожжи начали производить в 1792 г. в Германии. Дрожжи выращивают в биореакторах на мелассной среде аэробным глубинным способом при рН 4,4— 4,5 по так называемому приточному методу. В чистый аппарат вводят 70— 80 % теплой воды от необходимого для конечного разведения мелас сы (1 : 17-1 : 30) количества, добавляют 10% мелассы и раст воры солей, устанавливают оптимальные рН среды и темпера туру и начинают умеренную аэрацию (1 об/(об- мин). В такую среду вводят посевной материал. В течение первого часа среду не добавляют, а в последующие 10 ч ее вводят непрерывным потоком в количествах 5; 6; 7,2; 8,2; 9,2; 10,2; 11,4; 12,8; 11,0 и 9 % в час от общего количества среды. Аэрация в течение всего времени ферментации также меняется. В первый и последний час культивирования она меньше (1:1), а в период интенсивного размножения дрожжей достигает 1,5— 2,0 об/(об-мин). В та ких условиях дрожжи проходят все фазы развития. В стационар ной фазе роста культуру надо выдержать до полного созревания, т. е. до прекращения интенсивного почкования. Во время ферментации незначительно возрастают концентра ции среды (от 0,9 до 2,2 по сахариметру) и титруемая кислота (от 0,3 до 0,8 мл 1 н. раствора кислоты на 100 мл раствора). В таких условиях выход прессованных дрожжей составляет 150 % от количества использованного сахара (или 37,5 % сухой биомассы). После ферментации дрожжи отделяют от среды путем центри фугирования или фильтрации на фильтр-прессе, затем биомассу тщательно промывают водой. Прессованные дрожжи хранят при пониженной температуре (4— 6°С), так как при комнатной тем пературе бактерии и микромицеты быстро повреждают дрожже вые клетки. Хорошими считаются хлебопекарные дрожжи, которые насы щают тесто большим количеством диоксида углерода. Дози ровка прессованных дрожжей в тесто составляет обычно 1 — 1,5% к массе муки. Мука содержит ферменты (амилазу и протеазу , которые обеспечивают частичный гидролиз крахмала и белков муки, создавая благоприятный субстрат для роста дрож жей. В целях интенсификации процесса брожения в тесто можно добавить сахарозу или солодовый экстракт. В дрожжах, выра щенных на мелассе, много инвертазы. Мука содержит также много молочнокислых бактерий, созда ющих в тесте кислую среду, которая способствует росту дрож жей и предохраняет тесто от размножения посторонних микро организмов. В биомассе дрожжей около 50 % белков, свободные амино кислоты и витамины (см. приведенные ниже данные). Аминокислоты (г на 100 г СВ) Витамины (мкг/г СВ) Лизин 8,2 Инозит 3000 Лейцин 7,9 Холинхлорид 2 710 В алии 5,5 Ниацин 585 Изолсйцин 5,5 Тиамин монохлорид 165 Тирозин 5,0 л-Аминобензойная кисло- 160 Аргинин 5,0 та Треонин 4,8 Рибофлавин 100 Фенил ал анин 4,5 Пантотенат кальция 100 Гистидин 4,0 Пиридоксин монохлорид 20 Метионин 2,5 Фолиевая кислота 13 Цистин 1,5 Биотин 0,6 Триптофан 1,2 Дрожжи обогащают хлеб ценными вещестами. Человек ежед невно принимает с пищей около 2 г дрожжевой биомассы. Для длительного сохранения хлебопекарные дрожжи высушивают до содержания влаги 8— 9%. Пивные дрожжи и пиво При производстве пива обычно используют специально селек ционированные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae , а также дрожжи S . carlsbergensis и др. Выбор штамма является наиболее важным условием, определяющим свойства пива: его окраску, аромат, крепость. Пивное сусло после гидролиза крахмала ферментами ячмен ного солода содержит следующие углеводы (в % от общего количества углеводов): мальтозу — 53, глюкозу — 12, мальтот риозу— 13, декстрин — 22, небольшое количество мальтотетра озы. Пивные дрожжи ассимилируют мальтозу, глюкозу и маль- тотриозу, но не используют декстрины и мальтотетраозу. Поскольку сейчас популярны светлые сорта пива (с низким содержанием углеводов), генетики пытаются создать пивные дрожжи, способные ассимилировать декстрины. Для упрощения технологии пивоварения поставлена задача получить рекомбинантные пивные дрожжи, способные перера батывать крахмал непосредственно в этанол. Получен штамм S . cerevisiae с трансплантированным геном бактерии Bacillus subtilis , детерминизирующим р-глюканазу. Новый штамм не тре бует предварительного солодования ячменя. Пиво высокого качества можно получить только при отсутст вии в сбраживаемом растворе посторонних микроорганизмов, что требует соблюдения строгих мер предосторожности на всех стадиях пивоварения. В последние годы установлена способ ность дрожжей к самозащите обитаемого субстрата. Среди них обнаружены особые, агрессивные штаммы, уничтожающие другие виды микроорганизмов. Эти штаммы названы убийцами, или киллерами. Способность дрожжей убивать чужеродные мик роорганизмы определяется особыми генами, локализованными в цитоплазме клетки. Их деятельностью управляют хромосомные гены. Путем скрещивания дрожжей, имеющих агрессивные свойства, с промышленными пивными дрожжами получен штамм пивных дрожжей, убивающий дикие дрожжи. Селекционеры на деются получить штаммы пивных дрожжей, уничтожающие так же бактериальную микрофлору. Усовершенствовать пивные дрожжи можно также, индуцируя им способность к флокуляции (слипанию клеток) в конце ферментации, что позволяет удалить дрожжи из готового пива. Фло- куляция зависит от состава среды, условий культивирования, но одновременно является также генетически детерминированным свойством, контролируемым генами. Пивоварение можно отнести к весьма консервативным отраслям народного хозяйства. Это частично объясняется тем, что изготовление каждого сорта фирменного высококачественного пива традиционно связано с рядом взаимосвязанных техноло гических тонкостей. Тем не менее в пивоварении постоянно внед ряются новые технологические приемы, позволяющие интенсифицировать производственные процессы. Среди них наибольший интерес представляют непрерывные процессы, например непре рывное солодование, а также непрерывное брожение пивного сусла в специальных бродильных колоннах с рециркуляцией дрожжей при использовании флокулирующихся штаммов. Трудоемкий и продолжительный процесс солодования зерна заменяют обработкой его комплексом осахаривающих ферментов микробного происхождения. Для изготовления сусла можно за менить часть солода ферментолизатом муки (рис. 2). Такое сусло содержит как гидролизованный крахмал, так и гидроли зованные белки зерна и по химическому составу близко к нату ральному суслу, которое добавляют к ферментируемому суслу в небольших количествах в качестве источника вкусовых и арома тизирующих веществ. Соки и вина Важное место в рационе питания человека занимают фрук ты, овощи и ягоды в свежем виде или в виде консервов и соков. Современное производство соков немыслимо без применения фер ментов, среди которых ведущее место принадлежит пектина зам — комплексу ферментов, состоящему из полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и др. Пектиназы продуцируют микромицеты Aspergillus niger , бак терии Erwinia carotovora , Clostridium sp . и др. Применение пек- тиназ в производстве соков обусловлено тем, что они катали зируют гидролиз пектиновых веществ растительных клеток, тем самым освобождая сок из клеточных структур. В 1 л виноград ного сока содержится 0,2— 4,0 г пектина, еще больше его в яб лочном и томатном соках. При хранении сока пектин оседает. Освобождение сока от пектина обязательно при изготовлении сиропов путем упаривания, так как присутствие пектина может вызвать желеобразование. Обработка соков пектолитическими ферментами снижает содержание пектина до 50 мг/л. Классическим биотехнологическим процессом является вино делие. Виноделие, как известно, основано на сбраживании ягодных или фруктовых соков особыми штаммами дрожжей, в основном рода Saccharomyces (например, S . ellipsoideus ). На фоне традиционных приемов виноделия, передаваемых виноделами из поколения в поколение, происходит постепен ное вторжение современной биотехнологии. Совершенствуется техника приготовления и хранения соков, с помощью генной и клеточной инженерии создаются новые высокопродуктивные штаммы дрожжей, разрабатываются непрерывные процессы сбраживания сока с использованием иммобилизованных клеток. ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА Биотехнология/под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса/пере вод с английского/под ред. А. А. Баева. — М.: Мир, 1988. — 479 с. Биотехнология микробного синтеза/под ред. М. Е. Бекера — Рига: Зинатне, 1980. — 350 с. Воробьев Л. И. Техническая микробиология. — М.: Высшая школа, 1987. — 94 с. Д е б а б о в В. Г., Лившиц В. А. Биотехнология. — М.: Высшая шко ла, 1988. Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорга низмов. 1988. — 208 с. Л и е п и н ь ш Г. К-, Д у н ц е М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. — Рига: Зинатне, 1986. — 156 с. Переработка мелассы на спирт и другие продукты по безотходной технологии/под ред. П. И. Рудницкого. — М.: Агропромиздат, 1985. — 287 с. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов: перевод с англий ского/под ред. В. К. Плакунова. — М.: Мир, 1987. — 118 с. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии. Сборник: перевод с английского под ред. Г. К- Скрябина. — М.: Мир, 1984. — 172 с. Смирнов В. А. Пищевые кислоты. — М.: Легкая и пищевая промыш ленность, 1983. — 240 с. Basic biotechnology Ed. by John Bu'Lock and Bjern Kristiansen.— Acad. Press, London, Orlando San Diego, New York, Austin, Boston, Sydney Tokio, Toronto, 1987. — 561 p. The global 2000 report to the president: entering the twentyfirst century; including global future; time to act; vol. 1,2.— Blue Angel, Inc.. 1985. — 228 p.